SacI-HF
カタログ番号 |
サイズ |
濃度 |
価格 |
保存温度 |
|---|---|---|---|---|
| R3156S | 2,000 units | 20,000 units/ml | ¥7,000 | -20C |
| R3156L | 10,000 units | 20,000 units/ml | ¥28,000 | -20C |
| R3156M | 10,000 units | 100,000 units/ml | ¥28,000 | -20C |
製品カテゴリ>グループ
- 制限酵素>ハイフィデリティー(HF)制限酵素
- 制限酵素>制限酵素
備考
- 備考：制限酵素|制限酵素＞ハイフィデリティー(HF)制限酵素|制限酵素
特徴
認識部位:
| single letter code
説明:
ニュー・イングランド・バイオラボは様々な分子生物学実験に使用することのできる高品質な酵素を提供している。その中の一つが制限酵素であり、基礎研究や製品開発に基づいて新たな認識特異性を有する酵素を探索している。また、遺伝子改変技術により、既存の制限酵素の性能を向上させることにも成功した。これらの制限酵素は"ハイフィデリティー(High-Fidelity, HF)制限酵素"と命名され、DNA制限活性は野生型と同様のままに、スター活性が著しく低減されている。さらにHF制限酵素はすべてNEBuffer4を至適バッファーとしており、他の酵素との併用(ダブルダイジェスト)もより行いやすくなっている。また、Time-Saver品質としても定められており、一般的な条件下において基質DNAをわずか5分間で消化できるという機能も有している。なお、これらHF制限酵素のバイアルチューブの蓋はすべて紫色で統一されている。
ハイフィデリティー(High-Fidelity, HF)制限酵素の詳細はこちら
由来：
Streptomyces achromogenes (ATCC 12767)由来のSacIを遺伝子改変(Q117H/R200A)したものをクローニングした遺伝子を有する大腸菌
添付試薬：
NEBuffer 4 (10X)
BSA
酵素特性
各NEBufferにおける活性:
| NEBuffer 1: |  |
100% |
| NEBuffer 2: | |
50% |
| NEBuffer 3: | |
10% |
| NEBuffer 4: | |
100% |
NEBuffer 4以外を使用する際は酵素量を増やして使用すること。
メチル化感受性:
| dam methylation: 影響を受けない |
| dcm methylation: 影響を受けない |
| CpG methylation: 影響を受けない |
| 詳細: Methylation Sensitivity |
熱による失活:
65℃、20分間
長時間反応の適応性:
(+ + +) オーバーナイト反応などの長時間反応にも使用できる。酵素活性は少なくとも8時間は維持される。
More information about: Extended Digests with Restriction Enzymes
反応条件と保存条件
反応条件:
1X NEBuffer 4
100 μg/ml BSA
37℃でインキュベーションを行う。
1X NEBuffer 4 組成:
・20 mM Tris-acetate
・50 mM potassium acetate
・10 mM Magnesium Acetate
・1 mM Dithiothreitol
pH 7.9 @ 25°C
ユニット定義:
1ユニットは、全反応容量50 μl中、37℃で1時間において、1 μgの λ DNA (HindIII digest) を消化するために必要な酵素量として定義される。
・20,000 units/ml (R3156S)、(R3156L)
・100,000 units/ml (R3156M)
ユニットアッセイ基質:
λ DNA (HindIII digest)
酵素保存液組成:
100 mM NaCl
1 mM Dithiothreitol
0.1 mM EDTA
200 µg/ml BSA
50% Glycerol
pH 7.4 @ 25°C
保存温度:
-20℃
酵素希釈バッファー:
Diluent A
メモ
1．SacI-HFは50 mM以上の塩濃度で阻害される。残留塩を含むミニプレップDNAは切断されないことがあるので、70%エタノールで洗浄または透析により脱塩することを推奨する。
2. SacI-HF はGAGmCTCのシトシンメチル化に感受性があるが、GAGCTmC のシトシンメチル化及びGmAGCTCのアデニンメチル化には感受性が無い。
3．SacI-HF™はSacI (NEB #R0156)と同様のDNA切断活性を有するが、スター活性が低減されている。
FAQs (よくあるお問い合わせ)
- What does HF refer to following the name of the restriction enzyme?
- When should I choose the HF version of the enzyme?
- When is star activity a concern?
- Why does the HF version of the enzyme have a different recommended buffer than the wild type enzyme?
- When should I choose the High Fidelity (HF) version of the enzyme?
- Can the change in buffer preference of the HF enzyme be advantageous?
- Will the HF enzyme produce elevated star activity when used in a buffer other than the one recommended?
- What does it mean to be Time-Saver qualified?
- How is the improvement in fidelity of HF restriction endonucleases quantitated?
- What is the Fidelity Index (FI)?
- How does the level of star activity of SacI-HF compare to SacI?
- What is the difference between SacI-HF and SacI?
- What is the specific activity of SacI-HF?
- Is there any difference in the methylation sensitivity between SacI-HF and SacI?
- Is there a difference in cutting close to the ends between SacI-HF and SacI?
ロット品質管理
各ロットの品質管理は以下検査に基づいて行われており、検査結果はデータカードに記載されている。
ライゲーション/リカッティング効率:
20倍過剰のSacI-HF™で切断したDNA断片の95%以上をライゲーションできる(T4 DNA Ligase、1-2 μMの5'末端濃度を使用)。これらのうち、95%以上をリカットできることを確認する。
16時間のインキュベーション:
1 μgのDNAと100 unitsのSacI-HF™を含む50 μlの反応液を37℃で16時間インキュベーションする。電気泳動上において有為なヌクレアーゼによるDNA分解が起こらないことを確認する。
エキソヌクレアーゼのコンタミネーションチェック:
50 μlの反応溶液中、100 unitsのSacI-HF™および1 μgの1本鎖および2本鎖DNA([3H] E. coli DNA、105 cpm/μg)を加えたものを37℃において4時間インキュベーションする。この反応においてフリーの放射性ヌクレオチドの検出量が全体量の0.1%未満であることをエキソヌクレアーゼのコンタミネーションがないものとの判断基準している。
エンドヌクレアーゼのコンタミネーションチェック:
50 μlの反応溶液中、60 unitsのSacI-HF™および1 μgの ΦX174 RF I DNA を加えたものを37℃において4時間インキュベーションする。電気泳動上において、RFIIへの変換量が10％未満であることをエンドヌクレアーゼのコンタミネーションがないものとの判断基準している。
青/白スクリーニング検定:
lacZα遺伝子内に制限部位を有するベクターを用いて、10倍過剰の制限処理を行う。再度ライゲーションをおこなったものを大腸菌に形質転換を行い、Xgal/IPTG/Amp培地にプレーティングする。正しく切断されたものをライゲーションしたlacZα遺伝子には損傷がないため、青コロニーとして検出される。一方、切断末端1塩基消失しているなどの正しくない切断の場合には、白コロニーとして検出される。全コロニーのうち、青コロニーの出現頻度が97％以上であることを品質基準としている。
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