NEBuilder HiFi DNA アッセンブリー (アズサイエンス)

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NEBuilder HiFi DNA アッセンブリー (アズサイエンス)

【NEBuilder 実例集】

2022 年 NEBuilder クローニングコンテストに寄せられた、研究者の皆様の実際の使い方と声を掲載しています。60 ケースを超える実例の中から、皆様の参考にできるものがきっとお探しいただけます。

・第 1 章：2 断片 (ベクター + インサート、基本的な使い方）

・第 2 章：複数断片 (ベクター + 2 つ以上のインサート)

・第 3 章：シームレス (不要な配列を除去してアッセンブル)

・第 4 章：変異導入

・第 5 章：1 本鎖オリゴ DNA のアッセンブル

・第 6 章：その他のアッセンブル

*実例集だけもお申込みいただけます。

NEBuilder HiFi DNA アッセンブリーは制限酵素を使わずに簡単・迅速に、しかも好きな位置にシームレスクローニングができる方法です。Gibson アッセンブリのアップグレード版です。

方法はとても簡単で、ポジティブクローン取得率も高いため、クローニング時間を大幅に短縮できます。


1) ベクターをインバース PCR で増幅*（直鎖状化）
2) ベクターとの相同配列（15 bp）を付加したプライマーを使って目的 DNA を PCR
3) これらと NEBuilder マスターミックスを混ぜて15 分間反応
4) 形質転換

PCR の後にクリーンアップは不要、アッセンブル後はそのまま形質転換ができます。
もちろん制限酵素を使っても大丈夫、その際も不要な配列を削るので、好きな位置にシームレスクローニングが可能です。

NEBuilder の使い方のポイントはただ1つ、相同配列を付けるだけ

NEBuilder アッセンブリでクローニングするときのポイントはとてもシンプル、「連結部分に相同配列を付加するだけ」です。

相同配列はプライマーに付加するだけですので、制限サイトを付加するのと同じ感覚で作成、さらにオンラインツール： NEBuilder Assembly Tool で簡単に設計できます。また、Destination Plasmid などは必要なく、どのようなベクターも使用できます。

NEBuilder には 3 種類の特別な酵素が含まれており、同一反応溶液中にて連続的に反応が行われています。

5' 末端から DNA を削るエキソヌクレアーゼ、隙間を埋める DNA ポリメラーゼ、ベクターと目的 DNA を完全につなげるニックリガーゼにより、ニックがない完全な 2 本鎖 DNA プラスミドが完成します。

	不必要な配列を除去できることが、NEBuilder の最大の強みだと考えています。この性能は stop コドンを無くしたり、あるいは変異させた遺伝子を作ったりするのに非常に有用です。
	- aki様（大阪大学）詳細はこちら

シームレスクローニングとは、一言で言えば「つなぎ目のない」ようにコンストラクトを作成するクローニングです。

制限酵素とリガーゼを使った Traditional Cloning は今も多く使用されていますが、コンストラクト中に制限酵素部位 (= つなぎ目) が残ること、つまりシームレスではないことが欠点でした。

このつなぎ目をなくすような方法がシームレスクローニングであり、色々な方法が考案されています。

・制限酵素部位が残らない (継ぎ目がにない＝シームレス)

・制限酵素部位に依存することなく、自由にインサート DNA をベクターに挿入できる

・複数断片でも同時にクローニングできる

その中でも制限酵素と T4 DNA リガーゼを使わない Gibson アッセンブリ法が、効率が高く、配列に制限がないため、有名となりました。さらに Gibson の性能と拡張性を向上して NEBuilder が生まれたのです。

従来のクローニング方法では、制限酵素部位を選ばなければならない点、また長い insert を入れるのがかなり難しいという問題がありました。目的遺伝子は配列が極めて GCrich な特殊配列で、しかも比較的短いコンストラクトのため、自分の希望するバックボーンベクターに入れることが従来ならば非常に難しいはずでしたが、NEBuilder を用いることで、入れたいベクターの入れたい部位に簡単にクローニングすることが出来ました。

- HidenoriK 様 (O 大学) 詳細はこちら

NEBuilder アッセンブリでは基本的にベクターをインバース PCR で直鎖状にするため、制限酵素サイトによらず、制限酵素を使わず、好きな位置に目的 DNA をクローニングできます。

ベクターを制限酵素で切断してもOK、末端合わせの悩みなし！

ベクターをインバース PCR ではなく、制限酵素で切断して直鎖状にしても大丈夫です。この場合、以下のように相同配列面（アッセンブル面）をベクターの 3' 面に合わせます（①、②、③）。さらに NEBuilder には余分なベクター末端配列を除去できる能力があるため、制限酵素サイトが消えるように相同配列を設計すれば、シームレスクローニングが可能です（④）。

	世の中には同様の製品や格安な代替方法こそ存在しますが，クローニング成功率・価格・手間・酵素の保存安定性等を総合して，NEBuilder が最良の選択肢だと考えています。
	- シロイヌナズナでブーケトス様 (広島大学) 詳細はこちら

① ベクター + 目的 DNA 1 本 (計 2 本)

最もシンプルなアッセンブルです。アッセンブル効率が高く、ニックがないコンストラクトを作成して形質転換できるため、より多くのコロニーが得られます。

pUC19 ベクターと 2 kb DNA を使用して、各社製品でクローニングを実施。反応は各社推奨条件に従い、2 µl を NEB 5-alpha Competent E.coli (NEB #C2987) に形質転換、LB/Amp 培地に出現したコロニーをカウントした。

② ベクター + 目的 DNA 3 本 (計 4 本)

複数のインサートを使った場合でもアッセンブル効率が高く、より多くのコロニーを得ることができます。

pUC19 ベクターと 3 種類 DNA (lacZ) を使用して、各社製品でクローニング。反応は各社推奨条件に従い、2 µl を NEB 5-alpha Competent E.coli (NEB #C2987) に形質転換、LB/Amp/IPTG/X-Gal 培地上で青色に出現したコロニーをポジティブクローンとしてカウントした。

	従来の推奨プロトコルでは工程が多い上に時間も 1 週間程かかり、複数の試薬が必要でした。NEBuilder のクローニングに変えて、工程が減り、時間も半分程になり、クローニング試薬も NEBuilder のみになりました。
	- Mknot 様 (山口大学) 詳細はこちら

NEBuilder でのクローニングの最短ワークフローはインサートおよびベクターの PCR、アッセンブル、形質転換、確認のためのコロニー PCR とシーケンスです。しっかりと目的バンドが増幅できている (非特異的増幅がない) のであれば、PCR 産物を精製する必要はなくアッセンブル可能です。このため、従来の制限酵素/リガーゼを使ったワークフローに比べて工程が少なく、時間を大幅に短縮できます。

	ベクターよりも長いインサートを含む、4 つの DNA のアセンブリがこうも簡単にうまくいくとは思わなかったので驚きました。
	- 立花和則様 (東京工業大学) 詳細はこちら

NEBuiler は 2 ～ 4 断片はもちろん、さらに多くの断片（> 12）をアッセンブルすることが可能です。さらに、形質転換の前にアッセンブル反応溶液の一部を使って PCR も可能、容易にアッセンブルの確認が可能です。

ベクターと12 種類の DNA (数百 bp) を使用、各社製品の推奨条件でアッセンブル。アッセンブル産物をテンプレートとして PCR を実施。

	本当に PCR 産物を混ぜてインキュベートするだけで変異の入ったクローンが得られてしまったので、配列を確認したあとでも信じられないぐらいでした。
	- 橋本研志様 (東京理科大学大学) 詳細はこちら

NEBuilder は部位特異的変異導入を行うこともできます。変異を導入したい箇所でプライマーを設計、その部分を繋ぎ目として PCR 産物をアッセンブルをするだけです。さらに下図のように複数の変異導入部分でプライマーを作ることで、一度に複数の変異導入が可能です。

	CRISPR-Cas9 系を用いたゲノム編集を行なった。他社類似製品では困難だった 1 本鎖オリゴ DNA のアセンブルも、NEBuilder では問題なく成功した。
	- ピーチ様 (K 大学) 詳細はこちら

NEBuilder は 1 本鎖 DNA とベクターもアッセンブルできます。下記事例は 70 bases の 1 本鎖オリゴ DNA（5' 相同配列：25 bases + インサート：20 bases + 3' 相同配列：25 bases）をアッセンブルした結果ですが、95 ％以上がポジティブクローンでした。1 本鎖 DNA アッセンブルの場合、相同配列を少し長く（> 25 bases）付加しておくことがポイントです。

NEBuilder は大きなプラスミドの作成も可能です。この場合、形質転換には NEB 10-beta Competent E.coli（NEB #C3019）をお薦めします。さらに、ニックがない完全プラスミドであるため、アッセンブル溶液をテンプレートとして PCR や RCA (Rolling Circle Amplification) が可能です。

ベクターと 2 種類の DNA を使用して 20 kb DNA となるようにアッセンブルを行い、反応溶液をテンプレートとして Phi29 DNA ポリメラーゼで Rolling Circule Amplification を実施。増幅産物から EcoRI-HF と SrfI で目的遺伝子を切り出して電気泳動に供した。

アッセンブル産物を、直接 PCR の鋳型として使用して増幅し、無細胞タンパク質合成系でのタンパク質合成に使用します。学生だったころ、制限酵素処理やブラントエンドでのライゲーションを行っていましたが、「余計な配列が付加するし、時間がかかるし、効率が悪い」のにそれ以外の選択肢がなく、非常に疑問でした。特に、2 種類以上の制限酵素を使用する際のバッファー選択は、「なにこの制約・・」と謎に思いつつ実験していました。NEBuilder は、その頃の私がずっと求めていた理想のものです。今後の進化もとても楽しみです！

-加藤晃代様 (名古屋大学大学院) 詳細はこちら

NEBuilder ではアッセンブル反応中に連結面が完全にシールされ、ニックがない完全プラスミドが産生されます。他社同等品はアッセンブル反応中にはニックが修復されず、形質転換後に大腸菌内で修復されます。このため、NEBuilder の形質転換効率が高く、さらにアッセンブル溶液を一時保存して別の日に形質転換をしてもほとんど効率は低下しません (下記図参照)。また、アッセンブル産物をテンプレートとして直接 PCR などを行うことも可能です。

NEBuilder はこの 1 製品だけで様々なアプリケーションに対応できます。

① 2 断片のアッセンブル：最もシンプルなアッセンブルである。インサートDNA の両末端に15 bp のベクターとの相同配列を入れておく。120 bp 以上のインサート長が必要である。

② 4 断片アッセンブル：複数断片（4 断片）をアッセンブルできる。それぞれの相同配列を付加しておく。

③ 6 断片アッセンブル：複数断片（6 断片）をアッセンブルできる。それぞれの相同配列を付加しておく。

④ 12 断片アッセンブル：複数断片（12 断片）をアッセンブルできる。それぞれの相同配列を付加しておく。

⑤ 1 本鎖オリゴと 2 本鎖 DNA のアッセンブル：ベクターに1 本鎖 DNA をアッセンブルできる。この際、相同配列は 25 bp 以上と長くする。

⑥ アニーリングしたオリゴのアッセンブル：複数の合成オリゴと2 本鎖ベクターをアッセンブルできる。オリゴはそれぞれがオーバーラップするように設計する。

⑦ 3'/ 5' ミスマッチを除去してアッセンブル：ベクター末端に余分な配列があった場合、これを除去してアッセンブルできる（< 10 bp）。インサートDNA に付加する相同配列を設計するときに、余分な配列をスキップしておく。

⑧ 部位特異的アッセンブル：インサート DNA を PCR 増幅する際、プライマーの特異的配列部分に変異を入れておけば、それを反映した組換え DNA が作出できる。

アッセンブルや相同配列が難しいと感じている方もご安心ください。オンラインツール：NEBuilder Assembly Tool にベクター配列と目的 DNA 配列を入力して、挿入位置などを選択するだけで、簡単にプライマーが設計できます。初めての方も感覚的にツールが使えるだけでなく、動画でも解説をしています。さらに日本語マニュアルも完備していますので、この機会にぜひとも NEBuilder HiFi DNA Assembly をお試しください！　もちろん NEB の熟練したテクニカルサポートが成功までご支援します。

NEBuilder Assembly Tool の使い方

NEBuilder 日本語マニュアル

		これさえあればまずは大丈夫！基本フォーマット
		NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix
		#E2621S... 10 回... ￥23,000
		#E2621L... 50 回... ￥91,000
		#E2621X...250 回... ￥364,000

		コンピテントセル付き、< 10 kb のコンストラクトにお薦め
		NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit
		#E5520S... 10 回... ￥27,200


		コンピテントセル付き、> 10 kb のコンストラクトにお薦め
		NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle for Large Fragments
		#E2623S... 20 回... ￥71,400

NEBuilder を使ったクローニングには、PCR 酵素と大腸菌コンピテントセル、あるいは制限酵素が必要です。これらは一般的なクローニング用途のものであれば使用できますが、以下の試薬を使うことでさらに効率が向上できます。

		Q5 High-Fidelity DNA Polymerase
		Q5 は正確性が高く（>280 x Taq 、187 万塩基に1 つのエラーだけ）、増幅性も高く、さらに長いDNA も増幅できる（～ 20 kb）ため、NEBuilderとの相性は抜群です。

		NEB 5-alpha/10-beta Competent E.coli
		形質転換効率はクローニング効率に直結するため、1 x 10^9 cfu/µg pUC19 DNA の高い形質転換効率を示す NEB のコンピテントセルがお薦めです。

Q1.

NEBuilder と他社同等品とは何が違うのですか？

アッセンブル効率が高く、1本鎖DNAとベクターの連結など様々なアプリケーションができる点が異なります。

	NEBuilder	T社製品S	A社製品G
2 断片アッセンブル効率	◎	〇	〇
4 断片アッセンブル効率	◎	〇	〇
6 断片アッセンブル効率	◎	△	△
12 断片アッセンブル効率	◎	△	△
1 本鎖 DNA とベクターのアッセンブル	◎	✕	△
完全プラスミドの作製	◎	✕	〇
ミスマッチ配列の除去（余分な末端配列の除去）	◎	✕	△

Q2.

NEBuilder と Gibson (#E2611) は何が違うのですか？

・酵素と反応バッファーの改良により、アッセンブル効率と正確性が向上

・5' と 3' ミスマッチを除去できるため、より自由度が高いアッセンブルが可能

・ssDNA のアッセンブルが可能

・NEBuilder はライセンスフリー

・同じプライマーを使用できるため、切り替えが容易

Q3.

制限酵素で悩まない/要らない、と書いてあるのですが、使えないということですか？？

いいえ、制限酵素も使えます！　ベクターを直鎖状にする際にインバース PCR だけではなく、制限酵素で切断しても大丈夫です。この際、アッセンブル面を好きな位置 (末端から 10 bp 以内) に設定すれば、Traditional Cloning のような末端合わせに悩むことはなく、しかもシームレスクローニングが可能です。さらに、1 種類の制限酵素だけしか使わない場合でも、ベクター末端はアッセンブル反応中に速やかに削られるため、セルフライゲーションもほとんどおこりません。

Q4.

正確性が高くないって聞いたんですけど、大丈夫ですか？

大丈夫です！ Gibson (NEB#E2611) ではアッセンブル領域にエラーが入ることがありましたが、NEBuilder では超高正確性 DNA ポリメラーゼの採用により正確性が大きく向上、エラーが入る心配がなくなりました。

Q5.

短い DNA もクローニングできますか？

はい、可能です。長さに応じて以下のようにインサートを準備します。下に示す DNA 長は、相同配列を含めたサイズになります。

・ > 120 bp ： PCR で調製

・<120 bp ： 1 本鎖オリゴ DNA を合成

・大きなインサート： > 2 領域に分けて PCRで調製

Q6.

直鎖状のアッセンブルはできますか？

はい、環状プラスミド DNA の作成だけではなく、直鎖状 DNA も作ることができます。この場合、アッセンブル産物の 5' と 3' 末端は、約 40 塩基の 3' 突出末端となります。これをテンプレートとして PCR をすることで、完全な 2 本鎖 DNA が作製できます。

Q7.

PCR産物のクリーンアップは必要ですか？

いいえ、必要ではありません。非特異的産物がなく、アッセンブル反応への持ち込み量が 20 ％以下であれば、PCR 産物をクリーンアップなく使用することができます。ただし、非特異的増幅物がある、大量の残存プライマーがある、PCR 産物量をたくさん使用したい場合には、カラムやゲル抽出で精製をすることをお薦めします。

→ ゲル抽出にお薦め！サンプルもあります： Monarch DNA Gel Extraction Kit

→ クリーンアップにお薦め！サンプルもあります： Monarch PCR & DNA Cleanup Kit

Q8.

アッセンブル産物をテンプレートとして PCR することは可能ですか？

はい、NEBuilder でアッセンブルした DNA の連結面にはニックやギャップがないため、PCR などが可能です。

Q9.

アッセンブル産物の形質転換には、どのコンピテントセルが適していますか？

一般的なクローニング用大腸菌コンピテントセルであれば使用できますが、形質転換効率が > 1 x 10^9 cfu/µg pUC19 DNA の NEB のコンピテントセルをお薦めします。

・コンストラクトが < 10 kb：NEB 5-alpha Competent E.coli (または 5-alpha コンピ付き NEBuilder キット)

・コンストラクトが > 10 kb：NEB 10-beta Competent E.coli (または 10-beta コンピ付き NEBuilder キット)

他社・自作のコンピテントセルをご使用の場合、アッセンブル溶液を水で 4 倍に希釈したものを形質転換します。

Q10.

Taq DNA ポリメラーゼで増幅した PCR 産物を使用することは可能ですか？

可能です。Taq の増幅産物は 3'A ですが、これが不要な場合にはミスマッチとしてアッセンブル反応中に除去されます。

Q11.

長年、制限酵素とリガーゼを使ってクローニングをしてきました。本当に簡単にできるのですか？

簡単にできます。Traditional Cloning を数十年行ってきた方や初めてクローニングをする方も、多くが問題なくクローンを取得しています。不安な方は NEB テクニカルサポートが実験の成功までサポートをします。この機会にサンプルをご依頼して NEBuilder を体験してください！

Q12.

簡単で高効率でも、NEBuilder はコストが高いんでしょうか？

いいえ、そんなことはありません。一見すると高いように見えるのですが、NEBuilder クローニングはステップ数が少ないため、他に必要な試薬は PCR 酵素とコンピテントセルだけです。一方、Traditional Cloning では PCR 酵素とコンピテントセルに加えて、通常 2 種類の制限酵素、T4 DNA リガーゼ、場合によってはキナーゼやホスファターゼが必要です。さらに作業工程と時間、成功率 (ポジティブクローン取得率) を考えると、正しいコストが分かってくると思います。

	パンフレット：NEBuilder HiFi DNA Assembly
	パンフレット：クローニング・ガイド
	製品マニュアル (日本語)
	動画：原理と特長 (日本語字幕)
	動画：NEBuilder/Golden Gate のプライマーデザイン方法
	動画：プライマー設計ツールの使い方 (ベクターを PCR で増幅する場合)
	動画：プライマー設計ツールの使い方 (ベクターを制限酵素で切断する場合)
	動画：NEBioCalculator での DNA 反応量の計算方法
	オンラインツール：NEBuilder Assembly Tool (プライマーデザイン用)
	オンラインツール：NEBioCalculator (DNA 質量 - モル量の変換)

	製品マニュアル (英語)
	パンフレット：合成生物学 (他のアッセンブル方法が掲載)
	動画：ssDNA アッセンブリ
	動画：NEBuilder の 3' ミスマッチ除去
	動画：NEBUILDER HiFi について
	NEBuilder のガイドライン (反応中の推奨モル比)
	NEBuilder HiFi DNA Assembly 反応の最適化のヒント
	1 本鎖 DNA アッセンブルを利用したCRISPR-Cas9 ゲノム編集用 sgRNA-Cas9 発現コンストラクトの作成
	NEBuilder による部位特異的変異導入
	酵母発現カセットの作成
	Nanoliter Scale DNA Assembly Utilizing the NEBuilder® HiFi Cloning Kit with the Labcyte® Echo® 525 Liquid Handler

＊実例集だけもお申込みいただけます。

ご質問は弊社テクニカルサポートまでお問い合わせください。

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