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- NEBuilderクローニングコンテスト結果発表
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NEBuilder クローニングコンテストへの沢山のご応募、ありがとうございました。 厳正な審査の結果、入賞内容が決定しましたので、ここに発表します。 2023 年 6 月 5 日:実例集配布中!お申込みはこちらから |
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【審査総評】 |
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我々 NEB として初めてのコンテストであり、どれだけ応募していただけるか正直なところ不安もありました。実際は 60 件ものご応募をいただき、しかも一件一件のご応募に皆様からの NEBuilder に対する熱い思いが込められており、賞の選定には大変頭を悩ませました。「こんな使い方もできるのか!」とメーカー側も驚くような数多くのアッセンブルやアプリケーションをお寄せいただき、我々としても大変参考になりました。ご応募いただいた内容をまとめたアプリケーション集を 4 月以降に発行予定ですので、そちらもぜひご期待ください。 |
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【ご応募いただいた皆様へのお知らせ】 |
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参加賞並びに各賞のプレゼントは3月中旬~下旬を予定しています。今しばらくお待ちください。 |
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NEB 賞の aki 様からは 3 つのクローニング実例を寄せていただきました。以下にそれぞれを公開いたします 。どれも NEBuilder の性能を発揮した内容であり、さらにより成功率を高めるためのヒントも書かれていますので、是非ご参考ください。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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【アッセンブル / クローニング 内容】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
目的タンパク質の発現ベクターに GFP の Open reading frame (ORF) を挿入しました(図 1)。発現ベクター内の目的タンパク質 ORF の直後にある NotI で切断して、GFP ORF の PCR 産物を挿入しました。このとき、ORF の stop コドンをなくし、目的タンパク質と GFP が繋がるようにプライマーを設計しました。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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【アプリケーション】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GFPを融合させた目的タンパク質を培養細胞に発現させることで、その局在を調べました。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
【工夫した点や想いなど】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
不必要な配列を除去できることが、NEBuilder の最大の強みだと考えています。この性能は、本件のように stop コドンを無くしたり、あるいは変異させた遺伝子を作ったりするのに非常に有用です。従来のプロトコルでは、NEBuilder の 反応系は total 20μl だと思いますが、少なくても問題なく動きます。コツは DNA をいかに綺麗に切断し、精製するかだと思います。 |
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【アッセンブル / クローニング 内容】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
薬剤耐性遺伝子の発現ベクターに目的遺伝子のゲノム領域を挿入し、ターゲティングベクターを作製しました(図 2)。EcoRI で薬剤耐性遺伝子の両端を切断後、目的遺伝子のゲノム領域(arm 配列)の PCR 産物と混ぜて NEBuilder の反応をおこないました。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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【アプリケーション】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ノックアウトベクターを培養細胞に導入することで、目的遺伝子のノックアウト細胞を樹立しました。 |
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【工夫した点や想いなど】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4 断片でも難なく作り上げてくれるので、適当なベクターがあれば 1 ステップで色々なことができます。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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【アッセンブル / クローニング 内容】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
pX330 ( addgene #42230) に gRNA 配列を挿入するために、一本鎖オリゴを設計しました(図 3)。pX330 を BbsI で切断し、希釈した一本鎖オリゴとともに NEBuilder の反応をおこないました。 |
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【アプリケーション】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ノックアウトベクターを培養細胞に導入することで、目的遺伝子のノックアウト細胞を樹立しました。 |
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【工夫した点や想いなど】 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
一本鎖オリゴでもベクターに組み込めてしまうのはすごいです。pX330 は、培養細胞で CRISPR/Cas9 システムを動かすために最も利用されている発現ベクターです。pX330 へ gRNA 配列の組み込みは、オリゴを順鎖、逆鎖と二本発注後、ハイブリダイズさせたあとにライゲーションさせる方法が一般的かと思います。しかし、上記の方法なら、届いたオリゴを希釈するだけでいいので、ハイブリダイズさせる手間がいりません。また、一本の発注でいいので、二本保存するよりも保存箱を圧迫しません。欠点は、オリゴの納品に少し時間が必要かもしれないのと、ちょっとだけ割高になることでしょうか。
また、NEBuilder 溶液はおそらく形質転換を阻害するので、形質転換効率の低い自作のコンピテントセルを使用すると、生えるコロニーが一気に下がります(たぶん)。その場合は、DNA を精製するか、コンピテントセルを作り直す必要があります。 |
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