NEBuilder クローニングコンテストへの沢山のご応募、ありがとうございました。

厳正な審査の結果、入賞内容が決定しましたので、ここに発表します。

【審査総評】

我々 NEB として初めてのコンテストであり、どれだけ応募していただけるか正直なところ不安もありました。実際は 60 件ものご応募をいただき、しかも一件一件のご応募に皆様からの NEBuilder に対する熱い思いが込められており、賞の選定には大変頭を悩ませました。「こんな使い方もできるのか！」とメーカー側も驚くような数多くのアッセンブルやアプリケーションをお寄せいただき、我々としても大変参考になりました。ご応募いただいた内容をまとめたアプリケーション集を 4 月以降に発行予定ですので、そちらもぜひご期待ください。

【ご応募いただいた皆様へのお知らせ】

参加賞並びに各賞のプレゼントは3月中旬～下旬を予定しています。今しばらくお待ちください。

不必要な配列を除去できることが、NEBuilder の最大の強みだと考えています。この性能は、本件のように stop コドンを無くしたり、あるいは変異させた遺伝子を作ったりするのに非常に有用です。従来のプロトコルでは、NEBuilder の 反応系は total 20μl だと思いますが、少なくても問題なく動きます。コツは DNA をいかに綺麗に切断し、精製するかだと思います。

ノックアウトベクターを培養細胞に導入することで、目的遺伝子のノックアウト細胞を樹立しました。

pX330 ( addgene #42230) に gRNA 配列を挿入するために、一本鎖オリゴを設計しました（図 3）。pX330 を BbsI で切断し、希釈した一本鎖オリゴとともに NEBuilder の反応をおこないました。

ノックアウトベクターを培養細胞に導入することで、目的遺伝子のノックアウト細胞を樹立しました。

一本鎖オリゴでもベクターに組み込めてしまうのはすごいです。pX330 は、培養細胞で CRISPR/Cas9 システムを動かすために最も利用されている発現ベクターです。pX330 へ gRNA 配列の組み込みは、オリゴを順鎖、逆鎖と二本発注後、ハイブリダイズさせたあとにライゲーションさせる方法が一般的かと思います。しかし、上記の方法なら、届いたオリゴを希釈するだけでいいので、ハイブリダイズさせる手間がいりません。また、一本の発注でいいので、二本保存するよりも保存箱を圧迫しません。欠点は、オリゴの納品に少し時間が必要かもしれないのと、ちょっとだけ割高になることでしょうか。

また、NEBuilder 溶液はおそらく形質転換を阻害するので、形質転換効率の低い自作のコンピテントセルを使用すると、生えるコロニーが一気に下がります（たぶん）。その場合は、DNA を精製するか、コンピテントセルを作り直す必要があります。