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10 周年:NEBNext 次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬
トラブルシューティング
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NEBNext の販売開始から 10 年を迎えました。現在では > 6,000 の査読雑誌や各国のシーケンスセンターで使用されています。これから NGS を始める方も、すでに解析を行っている方も、今後とも NEBNext をご愛用ください!

 

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Q1.  はじめてライブラリー調製を行うのですが、大丈夫でしょうか?
Q2.  ライブラリー調製を成功させるための秘訣は何でしょうか?
Q3.  どうやって DNA / RNA サンプルを準備すればよいですか?
Q4.  どのくらいの DNA / RNA 量が必要ですか?
Q5.  ChIP-Seq 用のライブラリー調製キットはありますか?
Q6.  バクテリアのライブラリー調製にはどのキットを使えばいいですか? 
Q7.  マイクロバイオーム解析を行うにあたり、ホストからバクテリア DNA を分離できますか?
Q8.  植物のライブラリー調製にはどのキットを使えばいいですか? 
Q9.  ウイルスのライブラリー調製にはどのキットを使えばいいですか? 
Q10.  FFPE サンプルからもライブラリー調製できますか?
Q11.  アンプリコンシーケンス用のライブラリー調製はできますか?
Q12.  特殊なサンプルでもライブラリー調製ができますか?
Q13.  他社キットに比べて、NEBNext の長所は何でしょうか?
Q14.  どのキットを選べばよいでしょうか?
Q15.  ライブラリー調製キットにはアダプター/インデックスは含まれていますか?
Q16.  調製キット以外になにが必要ですか?
Q17.  調製済のライブラリーは、どれくらい保存が可能でしょうか?
Q18.  推奨のサーマルサイクラーはありますか?推奨以外のものでも大丈夫ですか?
Q19.  Nuclease free Water の代わりに DEPC 処理水を使う事はできますか?
Q20.  ライブラリーの定量にはどのような方法を推奨していますか?
Q21.  BioAnalyzer や TapeStation でライブラリーを定量しても良いですか?
Q22.  NEBNext Ultra II と Ultra(無印)は何が違うのですか?
Q23.  NEBNext FS キットと単品の断片化酵素(Fragmentase)は何が違うのですか?
Q24.  RNA ライブラリー調製キットのスタンダード(無印)とディレクショナル(Dorectional)は何が違うのですか?
Q25.  インデックスはどれを選べばよいですか? 
Q26.  NEB のインデックス配列は公開されていますか?
Q27.  アダプターはイルミナ社のものと同じですか?
Q28.  NEB のインデックス配列とイルミナのインデックス配列の対応について教えてください。
Q29.  Low plex でランする場合の推奨するインデックスの組み合わせについて教えてください。
Q30.  マグネットスタンドはどれを使えばよいですか?
Q31.  プロトコールに SPRIselect/NEBNext ビーズ推奨とありますが、AMPURE ビーズも使用できますか?
Q32.  ビーズ精製の注意点は何ですか?
Q33.  ライブラリー調製のコントロールは必要ですか?
Q34.  サンプルシートはどうやって設定すればよいですか?

 

 

Q1. はじめてライブラリー調製を行うのですが、大丈夫でしょうか?
  はい、NEB のキットは初めての方でも確実にライブラリー調製ができるような構成に加えて、分かりやすいマニュアルや資料、動画や FAQ を公開しています。またサンプル取得からシーケンスまで、経験豊富なテクニカルサポートが丁寧に対応をいたします。まずは冊子をご覧いただき、ご不明な点があればテクニカルサポートまでお気軽にお尋ねください。
 

image 冊子(DNA)     image 冊子(RNA)     image NEBNext ページ

 
Q2. ライブラリー調製を成功させるための秘訣はありますか?
  量・質ともに良好なサンプルを用いることが最も重要です。不純物のない高い精製度の DNA あるいは RNA を準備すること、各キットに必要な量を用いることができれば、ライブラリー調製は成功したと言っても過言ではありません。DNA / RNA の抽出・精製には Monarch 核酸精製カラムをお薦めします。
  image Monarch 核酸精製     image 動画(DNA インプットのヒント)     image 動画(RNA インプットのヒント)
   
Q3. どうやって DNA / RNA サンプルを準備すればよいですか?
 

検体によって異なりますが、市販のカラム精製キットや抽出試薬などがご利用いただけます。NEB からは Monarch ゲノム精製トータル RNA精製キットを販売しています。もちろんマニュアルで精製しても問題ありません。どの方法においても、以下のポイントを押さえた高品質な DNA / RNA サンプルを準備することが重要です。

・DNase / RNase 処理をする

・Nanodrop や Qubit などで正確に定量をする

・純度は A260 / 280 > 1.8 が良い

・RNA について、BioAnalyzer / TapeStation などで分解度を確認する(RIN)

・精製時のエタノールや有機溶媒の持ち込みに注意する

  image 冊子(DNA)     image 冊子(RNA)     image 動画(DNA インプットのヒント)     image 動画(RNA インプットのヒント)
   
Q4. どのくらいの DNA / RNA 量が必要ですか?
 

キットと目的によって異なりますが、最小量は以下のとおりです。詳細は各マニュアルをご確認ください。

・DNA : 100 pg(NEBNext Ultra II FS DNA の場合)

・RNA : 5 ng(rRNA depletion + NEBNext Ultra II Directional RNA の場合)

  image NEBNext Ultra II FS DNA     image NEBNext Ultra II Directional RNA
 
Q5. ChIP-Seq 用のライブラリー調製キットはありますか?
  はい、わずか 500 pg ChIP-DNA からライブラリーを調製できる NEBNext Ultra II DNA Kit をお薦めします。ChIP アッセイ後、qPCR による濃縮と電気泳動による断片化を確認することがポイントです。
  image ChIP-DNA 調製のポイント
   
Q6. バクテリアのライブラリー調製にはどのキットを使えばいいですか? 
 

バクテリアの DNA / RNA ライブラリー調製にはそれぞれ以下のキットをお薦めします。


【DNA】 

断片化からライブラリー調製までできる NEBNext Ultra II FS DNA Kit がおすすめです。 あるいはあらかじめコバリスなどで物理的に断片化したゲノム DNA を用いる場合や、菌叢解析などを目的とした PCR アンプリコン(約300 bp)の場合は NEBNext Ultra II DNA Kit で調製可能です。 いずれもアダプターオリゴが別途必要です。

 

微生物種やサンプルよっては DNA 精製時に検体中の糖や培地中の重金属などが夾雑することがあり、ライブラリー調製を阻害することがありますので、しっかりと DNA 精製をおこなうこと、あるいは あえて DNA 使用量を少なくして夾雑物持ち込みを少なくすることがポイントです。


【RNA】

バクテリア の mRNA は非ポリ A タイプであるため、rRNA 除去をしてからライブラリー調製を行います。バクテリア用 rRNA 除去キット NEBNext Ultra II Directional RNA Kitアダプターオリゴが必要です。

 

image NEBNext Ultra II FS DNA     image NEBNext Ultra II DNA    image NEBNext Ultra II Directional RNA    image アダプターオリゴ

 
Q7. マイクロバイオーム解析を行うにあたり、ホストからバクテリア DNA を分離できますか?
 

はい、NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit を使えば、真核生物ホスト DNA からバクテリア DNA を分離することが可能です。 真核生物のゲノム DNA が CpG メチル化されている一方、バクテリアのゲノム DNA は CpG メチル化されていないことを利用して、メチル化 DNA 結合ビーズで真核生物 DNA だけをトラップ、バクテリア DNA を分離します。 ビーズにトラップした真核生物 DNA も回収可能です。

 

image Microbiome DNA Enrichment Kit  

   
Q8. 植物のライブラリー調製にはどのキットを使えばいいですか ? 
 

植物の DNA / RNA ライブラリー調製にはそれぞれ以下のキットをお薦めします。


【DNA】

断片化からライブラリー調製までできる NEBNext Ultra II FS Kit がおすすめです。ただし植物から 抽出した DNA には糖が夾雑することが多く、ライブラリー調製が阻害されることがありますので、しっかりと DNA 精製をおこなうこと、あるいは あえて DNA 使用量を少なくして夾雑物持ち込みを少なくすることがポイントです。

 

【RNA (RIN > 7)】

トータル RNA からポリ A-mRNA を精製してからライブラリー調製を行います。mRNA 精製キットと NEBNext Ultra II Directional RNA Kitアダプターオリゴを使用します。

 

image NEBNext Ultra II FS DNA     image NEBNext Ultra II DNA    image NEBNext Ultra II Directional RNA     image アダプターオリゴ

   
Q9. ウイルスでもライブラリー調製ができますか? 
 

はい、可能です(一部除く)。 ウイルス種によって使用キットが異なります。


【DNA ウイルス】

2 本鎖 DNA の場合、NEBNext Ultra II FS DNA Kit で調製可能です。1 本鎖 DNA の場合やホストとの分離が必要な場合、状況によって調製の可否が異なりますので、テクニカルサポートまでお問合せください。


【RNA ウイルス】

RNA の場合、2 本鎖/1 本鎖とも調製可能です。RNA ライブラリー調製キットアダプターオリゴが必要です。ウイルス RNA が単離・精製できれいるのであれば、前処理試薬は基本的に不要です。

 

image NEBNext Ultra II FS DNA     image NEBNext Ultra II Directional RNA     image アダプターオリゴ

 
Q10. FFPE サンプルからもライブラリー調製できますか?
 

はい、可能です。FFPE 由来 DNA は分解度によって異なるライブラリー調製キットを選択します。FFPE 由来 RNA の場合、キットの他に前処理として rRNA 除去キットが必要です。各製品マニュアルには FFPE サンプルに対応したプロトコールが掲載されています。

 

・FFPE DNA(分解度が低い場合) : 物理的断片化 + NEBNext Ultra II DNA Kit

・FFPE DNA(分解度が高く、断片化が必要ない場合) : NEBNext Ultra II DNA Kit 

  * FFPE DNA 中の酸化ダメージや脱アミノ化(ウラシル化)を修復できる FFPE DNA 修復酵素も効果的です。


・FFPE RNA(分解度を問わない): rRNA 除去キット** + NEBNext Ultra II Directional RNA Kit

**ヒト/マウス/ラットに限る

  image NEBNext Ultra II DNA     image FFPE DNA 修復試薬*     image FFPE DNA ライブラリー調製例(英語)
 
Q11. アンプリコンシーケンス用のライブラリー調製はできますか?
 

はい、可能です。アンプリコンのサイズ(断片化の必要性)によって異なるキットを使用します。

 

・200- 300 bp(断片化は不要) : NEBNext Ultra II DNA Kit

・> 1kb (断片化は必要): NEBNext Ultra II FS DNA Kit

・上記以外 : テクニカルサポートにご相談ください

 
Q12. 特殊なサンプルでもライブラリー調製ができますか?
 

サンプルによって可否が異なりますが、NEBでは様々なサンプルに対応するための前処理試薬を提供しています。以下は特殊なサンプルの一例ですが、他にも様々なサンプル事例があります。各製品ページの「製品情報 Product Information (English)」から、「Citation & Technical Literature」に参考文献リストが掲載されていますので、ご参照ください。

 

・法医学サンプル(血痕など)

・博物学サンプル(数十年以上保管している標本や古代試料など)

・環境 DNA サンプル

・メチル化解析 など

  image FFPE DNA 修復試薬
 
Q13. 他社キットに比べて、NEBNextの長所は何でしょうか?
 

様々な長所があります。

 

・高収量かつ低バイアスなライブラリー調製が可能

・微量サンプルからも調製可能(DNA:100 pg~、RNA:シングルセル~)

・豊富なオプションキットにより、様々なサンプルからライブラリーを調製可能

・国内常時在庫のため、最短 1 日で納品

・経験豊富なテクニカルサポート

 
Q14. どのキットを選べばよいでしょうか?
 

まずは NEBNext トップページより、サンプルの種類と解析目的から製品グループを選択します。続いてサンプルの分解度や詳細な解析目的から簡単にお選びいただけます。オンラインツール:NEBNext Selector も便利です。ご不明な点がございましたらテクニカルサポートまでお気軽にお尋ねください。

  image NEBNext ページ   image オンラインツール:NEBNext Selector 
 
Q15. ライブラリー調製キットにはアダプター/インデックスは含まれていますか?
 

プレックス数に応じて柔軟に選択するため、基本的には調製キット(試薬)とオリゴキット(アダプター+インデックス・プライマー)は別売となっています。オリゴキットはプレックス数より選択します。ただし下記キットには専用のオリゴが付属しています。

 

・NEBNext Small RNA Kit(Small RNA ライブラリー調製キット)

・NEBNext EM-Seq Kit(メチル化解析キット)

  image オリゴ(インデックス)キットの選択方法
 
Q16. 調製キット以外になにが必要ですか?
 

ライブラリー調製キットには各ステップの酵素とバッファーが含まれています。このキットの他に、以下が必要です。詳細は各キットマニュアルをご参照ください。

 

・オリゴキット(アダプター&インデックスプライマー)

・前処理試薬(mRNA 精製など、サンプルや目的によって異なる)

・DNA 精製ビーズ(SPRIselect、AMPUREなど、ビーズ付きキットも販売しています)

・汎用試薬(エタノールなど)

・マグネットスタンド(S1515S など)

 
Q17. 調製したライブラリーは、どれくらい保存が可能でしょうか?
 

-20 ℃ で少なくとも 6 か月保存ができることを弊社で確認しています。

 
Q18. 推奨のサーマルサイクラーはありますか? 推奨以外のものでも大丈夫ですか?
 

Heat lid 調整ができる機種であれば、特に推奨はありません。ただしサーマルサイクラー機器メーカーが推奨しているチューブ/プレートを必ずご使用ください。

 
Q19. Nuclease free Water の代わりに DEPC 処理水を使う事はできますか?
 

DEPC 処理水の品質はラボによって様々であり、一部の酵素反応に影響することがあるため、NEB では推奨していません。

 
Q20. ライブラリーの定量にはどのような方法を推奨していますか?
 

P5 / P7 配列にアニールするプライマーを使用したリアルタイム PCR をお薦めしています(NEBNext Library Quant Kit for Illumina)。

  image NEBNext Library Quant Kit for Illumina
 
Q21. BioAnalyzer や TapeStation でライブラリーを定量しても良いですか?
 

BioAnalyzer や TapeStation などでも濃度を測定、その値を使用することは可能です。しかしながら正確性と再現性はリアルタイム PCR に劣るため、シーケンスフローセル内でのクラスターが最適密度で形成されず、シーケンス効率の低下(リードあたりのコストアップ)を招く恐れがあります。シーケンス効率を最大にするためには、リアルタイム PCR での定量をお薦めします。

  image BioAnalyzer と qPCR の定量の違い image NEBNext Library Quant Kit for Illumina
 
Q22. NEBNext Ultra II と Ultra(無印)は何が違うのですか?
 

Ultra II は調製効率とワークフローが改良された最新のライブラリー調製キットシリーズです。これからご使用の方は Ultra II をお薦めします。

Ultra(無印)は、Ultra II の以前から販売している調製キットです。一連の研究においては同じキットを使用することがよいとされているため、継続ご使用者様用に販売を継続しています。

 

Q23.

 

NEBNext Ultra II FS DNA キットでの断片化と、単品の断片化酵素(Fragmentase)は何が違うのですか?

 

どちらも DNA をランダムに断片化する機能としては同じですが、使用している酵素とメカニズム、ワークフローが異なります。基本的には断片化と End Prep(5' リン酸化、平滑化、3'A 付加) がシングルチューブでできる NEBNext Ultra II DNA FS kit をお薦めしています。特殊なサンプルで断片化条件の最適化が必要な場合、Fragmentase のほうが良いケースがあります。Fragmentase を用いる場合、基本的には断片化後にクリーンアップが必要です。

  image NEBNext Ultra II DNA FS kit     image Fragmentase
   
Q24. NEBNext Ultra II RNA ディレクショナル とスタンダードは何が違うのですか?
 

ディレクショナル(Stranded)は RNA から合成された cDNA(2 本鎖)の 第 1 鎖だけからライブラリーが調製されるため、シーケンスリードは元の RNA の方向性を保っています。センス鎖、アンチセンス鎖を区別して解析する場合や、アッセンブルする場合に効果的です。最近の RNA シーケンスの主流です。

 

スタンダートキットは、RNA から合成された cDNA(2 本鎖)のそれぞれからライブラリーが調製されるため、シーケンスリードは順向き/逆向きの両方が得られます。センス鎖、アンチセンス鎖の区別はできません。

  image NEBNext Ultra II Directional RNA kit     image NEBNext Ultra II RNA kit
   
Q25. インデックスはどれを選べばよいですか? 
 

2 つの点から選択します。詳細はアダプターオリゴ&インデックスプライマーページをご覧ください。あるいは下記情報を添えてテクニカルサポートまでお尋ねください。

 

・プレックス数(1 レーンで同時に何サンプルを解析するか、何サンプルをプールしてシーケンスするか)

・シングルタイプ(P7 側だけにインデックスが付加)か、デュアルタイプ(P5/P7 の両方にインデックスが付加)

 

 

【デュアル・インデックスが付加したライブラリー】

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Q26. NEB の Index 配列は公開されていますか?
 

はい、公開をしています。各インデックスキットのマニュアルをご参照ください。

  例:NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)(製品番号:E7335)のマニュアル image
 

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Q27. アダプターはイルミナ社のものと同じですか?
 

構造と配列に相違点があります。

 

【構造】

・共通点:いずれも3'A末端構造を有しており、T/Aアダプターライゲーションにより付加します。

・異なる点:NEB のアダプターはウラシルを介したループ状構造となっています。この特殊な構造により、アダプターライゲーションの効率向上と、アダプターダイマー形成の抑制を可能としています。なおイルミナ社のアダプターは Y 字構造となっています。


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【配列】

NEB のアダプターはRead 1/2配列が含まれていますが、インデックス配列と P5/7 配列は含まれていません。これらは PCR ステップで付加され、完全なライブラリーとなります(右図)。

 

Read 1/2 P5/7 配列はイルミナ社 TruSeq シリーズと共通しています(Small RNA 用キット除く)。インデックス配列は一部共通しています。

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Q28. NEB の Index 配列とイルミナの Index 配列の対応について教えてください。
 

以下キットはイルミナ社と同じインデックス配列・番号となっています。

 

・E7335 & E7500:Truseq Set A&B

・E7600:Truseq HT Index

 

上記以外のインデックスはNEBオリジナルのものとなっています。各キットのマニュアルに配列を公開、製品個別ページにサンプルシートを公開しています。

   
   
Q29. Low plexでランする場合の推奨するインデックスの組み合わせについて教えてください。
 

インデックスキットによって異なり、推奨の組み合わせは各マニュアルに記載されています。

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1、#E7335の場合、以下のようになっています。

 

・2 plex:Index 6 & 12

・3 plex:Index 4, 6 & 12

・6 plex:Index 2, 4, 5, 6, 7 & 12

 

 

【2 plex の時の有効、無効の組み合わせ例】

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Q30. マグネットスタンドはどれを使えばよいですか?
 

0.2 ml 用 PCR チューブに対応するものであればどれでも構いませんが、ビーズが底面ではなく壁面に吸着されるタイプをお薦めします(上清回収/破棄がやりやすいため)。NEB からも専用のスタンドを販売しています。

  image NEBNext Magnetic Separation Rack   image 動画(ビーズ精製のヒント)
   
Q31. SPRIselect/NEBNext ビーズが推奨されていますが、AMPURE  ビーズも使用できますか?
 

サイズセレクション機能検証がされている SPRIselect/NEBNext ビーズを推奨します。AMPURE でも可能ですが、問題が無いことをご検証の上、ご使用ください。その際、マニュアルに記載の SPRIselect/NEBNext ビーズと同じ量をご使用ください。

   
Q32. ビーズ精製の注意点は何ですか?
 

主に3つのポイントがあります。実際の精製動画も合わせてご参照ください。


・使用前にビーズを十分に懸濁して、均一のビーズ溶液を使用する

・上清を回収/破棄する際に吸着したビーズを取らない*

・ビーズ乾燥時、乾燥しすぎない

   * NEB の専用ラックを使用すれば、ビーズ吸着の様子が観察しやすく、確実に精製が可能です。

  image NEBNext Magnetic Separation Rack   image 動画(ビーズ精製のヒント)
   
Q33. ライブラリー調製のコントロールは必要ですか?
 

基本的には必要ありませんが、特殊なサンプルからライブラリー調製を行う場合、市販のリファレンス DNA / RNA がコントロールとして使用可能です。NEB のライブラリー調製キットの品質管理に使用しているリファレンスは以下などになります。

 

・DNA:Human NA19240 genomic DNA (Coriell #GM19240)

・RNA:Human Universal Reference RNA (Agilent #740000)

   
Q34.

サンプルシートはどうやって設定すればよいですか?

 

基本的にはイルミナ社 Illumina Experimental Manager (IEM)を使用してシートを作成します。まずはデフォルト設定で仮シートを作成して保存、csv ファイルとして開いて NEB インデックス配列を記入します。インデックス配列は各キットのマニュアルをご参照ください。また IEM の使用方法につきましては、イルミナ社にお問合せください。

   

 

 

NEBNext DNA ライブラリー調製冊子 image  NEBNext トップへ戻る
NEBNext RNA ライブラリー調製冊子 image  

 

本製品に関するご質問は下記テクニカルサポートまでお問い合わせください。

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