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検体によって異なりますが、市販のカラム精製キットや抽出試薬などがご利用いただけます。NEB からは Monarch ゲノム精製・トータル RNA精製キットを販売しています。もちろんマニュアルで精製しても問題ありません。どの方法においても、以下のポイントを押さえた高品質な DNA / RNA サンプルを準備することが重要です。

・DNase / RNase 処理をする

・Nanodrop や Qubit などで正確に定量をする

・純度は A260 / 280 > 1.8 が良い

・RNA について、BioAnalyzer / TapeStation などで分解度を確認する（RIN）

・精製時のエタノールや有機溶媒の持ち込みに注意する

キットと目的によって異なりますが、最小量は以下のとおりです。詳細は各マニュアルをご確認ください。

・DNA ： 100 pg（NEBNext Ultra II FS DNA の場合）

・RNA ： 5 ng（rRNA depletion + NEBNext Ultra II Directional RNA の場合）

バクテリアの DNA / RNA ライブラリー調製にはそれぞれ以下のキットをお薦めします。

【DNA】 

断片化からライブラリー調製までできる NEBNext Ultra II FS DNA Kit がおすすめです。　あるいはあらかじめコバリスなどで物理的に断片化したゲノム DNA を用いる場合や、菌叢解析などを目的とした PCR アンプリコン（約300 bp）の場合は NEBNext Ultra II DNA Kit で調製可能です。　いずれもアダプターオリゴが別途必要です。

微生物種やサンプルよっては DNA 精製時に検体中の糖や培地中の重金属などが夾雑することがあり、ライブラリー調製を阻害することがありますので、しっかりと DNA 精製をおこなうこと、あるいは あえて DNA 使用量を少なくして夾雑物持ち込みを少なくすることがポイントです。

【RNA】

バクテリア の mRNA は非ポリ A タイプであるため、rRNA 除去をしてからライブラリー調製を行います。バクテリア用 rRNA 除去キットと NEBNext Ultra II Directional RNA Kit、アダプターオリゴが必要です。

 NEBNext Ultra II FS DNA      NEBNext Ultra II DNA     NEBNext Ultra II Directional RNA     アダプターオリゴ

はい、NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit を使えば、真核生物ホスト DNA からバクテリア DNA を分離することが可能です。 真核生物のゲノム DNA が CpG メチル化されている一方、バクテリアのゲノム DNA は CpG メチル化されていないことを利用して、メチル化 DNA 結合ビーズで真核生物 DNA だけをトラップ、バクテリア DNA を分離します。　ビーズにトラップした真核生物 DNA も回収可能です。

 Microbiome DNA Enrichment Kit  

植物の DNA / RNA ライブラリー調製にはそれぞれ以下のキットをお薦めします。

【DNA】

断片化からライブラリー調製までできる NEBNext Ultra II FS Kit がおすすめです。ただし植物から 抽出した DNA には糖が夾雑することが多く、ライブラリー調製が阻害されることがありますので、しっかりと DNA 精製をおこなうこと、あるいは あえて DNA 使用量を少なくして夾雑物持ち込みを少なくすることがポイントです。

【RNA （RIN > 7）】

トータル RNA からポリ A-mRNA を精製してからライブラリー調製を行います。mRNA 精製キットと NEBNext Ultra II Directional RNA Kit、アダプターオリゴを使用します。

 NEBNext Ultra II FS DNA      NEBNext Ultra II DNA     NEBNext Ultra II Directional RNA      アダプターオリゴ

はい、可能です（一部除く）。　ウイルス種によって使用キットが異なります。

【DNA ウイルス】

2 本鎖 DNA の場合、NEBNext Ultra II FS DNA Kit で調製可能です。1 本鎖 DNA の場合やホストとの分離が必要な場合、状況によって調製の可否が異なりますので、テクニカルサポートまでお問合せください。

【RNA ウイルス】

RNA の場合、2 本鎖/1 本鎖とも調製可能です。RNA ライブラリー調製キットとアダプターオリゴが必要です。ウイルス RNA が単離・精製できれいるのであれば、前処理試薬は基本的に不要です。

 NEBNext Ultra II FS DNA      NEBNext Ultra II Directional RNA      アダプターオリゴ

はい、可能です。FFPE 由来 DNA は分解度によって異なるライブラリー調製キットを選択します。FFPE 由来 RNA の場合、キットの他に前処理として rRNA 除去キットが必要です。各製品マニュアルには FFPE サンプルに対応したプロトコールが掲載されています。

・FFPE DNA（分解度が低い場合） ： 物理的断片化 + NEBNext Ultra II DNA Kit

・FFPE DNA（分解度が高く、断片化が必要ない場合） ： NEBNext Ultra II DNA Kit 

  * FFPE DNA 中の酸化ダメージや脱アミノ化（ウラシル化）を修復できる FFPE DNA 修復酵素も効果的です。

・FFPE RNA（分解度を問わない）： rRNA 除去キット** + NEBNext Ultra II Directional RNA Kit

**ヒト/マウス/ラットに限る

はい、可能です。アンプリコンのサイズ（断片化の必要性）によって異なるキットを使用します。

・200- 300 bp（断片化は不要） ： NEBNext Ultra II DNA Kit

・> 1kb （断片化は必要）： NEBNext Ultra II FS DNA Kit

・上記以外 ： テクニカルサポートにご相談ください

サンプルによって可否が異なりますが、NEBでは様々なサンプルに対応するための前処理試薬を提供しています。以下は特殊なサンプルの一例ですが、他にも様々なサンプル事例があります。各製品ページの「製品情報 Product Information (English)」から、「Citation & Technical Literature」に参考文献リストが掲載されていますので、ご参照ください。

・法医学サンプル（血痕など）

・博物学サンプル（数十年以上保管している標本や古代試料など）

・環境 DNA サンプル

・メチル化解析　など

様々な長所があります。

・高収量かつ低バイアスなライブラリー調製が可能

・微量サンプルからも調製可能（DNA：100 pg~、RNA：シングルセル～）

・豊富なオプションキットにより、様々なサンプルからライブラリーを調製可能

・国内常時在庫のため、最短 1 日で納品

・経験豊富なテクニカルサポート

まずは NEBNext トップページより、サンプルの種類と解析目的から製品グループを選択します。続いてサンプルの分解度や詳細な解析目的から簡単にお選びいただけます。オンラインツール：NEBNext Selector も便利です。ご不明な点がございましたらテクニカルサポートまでお気軽にお尋ねください。

プレックス数に応じて柔軟に選択するため、基本的には調製キット（試薬）とオリゴキット（アダプター＋インデックス・プライマー）は別売となっています。オリゴキットはプレックス数より選択します。ただし下記キットには専用のオリゴが付属しています。

・NEBNext Small RNA Kit（Small RNA ライブラリー調製キット）

・NEBNext EM-Seq Kit（メチル化解析キット）

ライブラリー調製キットには各ステップの酵素とバッファーが含まれています。このキットの他に、以下が必要です。詳細は各キットマニュアルをご参照ください。

・オリゴキット（アダプター＆インデックスプライマー）

・前処理試薬（mRNA 精製など、サンプルや目的によって異なる）

・DNA 精製ビーズ（SPRIselect、AMPUREなど、ビーズ付きキットも販売しています）

・汎用試薬（エタノールなど）

・マグネットスタンド（S1515S など）

-20 ℃ で少なくとも 6 か月保存ができることを弊社で確認しています。

Heat lid 調整ができる機種であれば、特に推奨はありません。ただしサーマルサイクラー機器メーカーが推奨しているチューブ/プレートを必ずご使用ください。

DEPC 処理水の品質はラボによって様々であり、一部の酵素反応に影響することがあるため、NEB では推奨していません。

P5 / P7 配列にアニールするプライマーを使用したリアルタイム PCR をお薦めしています（NEBNext Library Quant Kit for Illumina）。

BioAnalyzer や TapeStation などでも濃度を測定、その値を使用することは可能です。しかしながら正確性と再現性はリアルタイム PCR に劣るため、シーケンスフローセル内でのクラスターが最適密度で形成されず、シーケンス効率の低下（リードあたりのコストアップ）を招く恐れがあります。シーケンス効率を最大にするためには、リアルタイム PCR での定量をお薦めします。

Ultra II は調製効率とワークフローが改良された最新のライブラリー調製キットシリーズです。これからご使用の方は Ultra II をお薦めします。

Ultra（無印）は、Ultra II の以前から販売している調製キットです。一連の研究においては同じキットを使用することがよいとされているため、継続ご使用者様用に販売を継続しています。

Q23.

NEBNext Ultra II FS DNA キットでの断片化と、単品の断片化酵素（Fragmentase）は何が違うのですか？

どちらも DNA をランダムに断片化する機能としては同じですが、使用している酵素とメカニズム、ワークフローが異なります。基本的には断片化と End Prep（5' リン酸化、平滑化、3'A 付加） がシングルチューブでできる NEBNext Ultra II DNA FS kit をお薦めしています。特殊なサンプルで断片化条件の最適化が必要な場合、Fragmentase のほうが良いケースがあります。Fragmentase を用いる場合、基本的には断片化後にクリーンアップが必要です。

ディレクショナル（Stranded）は RNA から合成された cDNA（2 本鎖）の 第 1 鎖だけからライブラリーが調製されるため、シーケンスリードは元の RNA の方向性を保っています。センス鎖、アンチセンス鎖を区別して解析する場合や、アッセンブルする場合に効果的です。最近の RNA シーケンスの主流です。

スタンダートキットは、RNA から合成された cDNA（2 本鎖）のそれぞれからライブラリーが調製されるため、シーケンスリードは順向き/逆向きの両方が得られます。センス鎖、アンチセンス鎖の区別はできません。

2 つの点から選択します。詳細はアダプターオリゴ＆インデックスプライマーページをご覧ください。あるいは下記情報を添えてテクニカルサポートまでお尋ねください。

・プレックス数（1 レーンで同時に何サンプルを解析するか、何サンプルをプールしてシーケンスするか）

・シングルタイプ（P7 側だけにインデックスが付加）か、デュアルタイプ（P5/P7 の両方にインデックスが付加）

【デュアル・インデックスが付加したライブラリー】

はい、公開をしています。各インデックスキットのマニュアルをご参照ください。

以下キットはイルミナ社と同じインデックス配列・番号となっています。

・E7335 & E7500：Truseq Set A&B

・E7600：Truseq HT Index

上記以外のインデックスはNEBオリジナルのものとなっています。各キットのマニュアルに配列を公開、製品個別ページにサンプルシートを公開しています。

インデックスキットによって異なり、推奨の組み合わせは各マニュアルに記載されています。

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1、#E7335の場合、以下のようになっています。

・2 plex：Index 6 ＆ 12

・3 plex：Index 4, 6 ＆ 12

・6 plex：Index 2, 4, 5, 6, 7 ＆ 12

【2 plex の時の有効、無効の組み合わせ例】

0.2 ml 用 PCR チューブに対応するものであればどれでも構いませんが、ビーズが底面ではなく壁面に吸着されるタイプをお薦めします（上清回収/破棄がやりやすいため）。NEB からも専用のスタンドを販売しています。

サイズセレクション機能検証がされている SPRIselect/NEBNext ビーズを推奨します。AMPURE でも可能ですが、問題が無いことをご検証の上、ご使用ください。その際、マニュアルに記載の SPRIselect/NEBNext ビーズと同じ量をご使用ください。

主に3つのポイントがあります。実際の精製動画も合わせてご参照ください。

・使用前にビーズを十分に懸濁して、均一のビーズ溶液を使用する

・上清を回収/破棄する際に吸着したビーズを取らない*

・ビーズ乾燥時、乾燥しすぎない

   * NEB の専用ラックを使用すれば、ビーズ吸着の様子が観察しやすく、確実に精製が可能です。

基本的には必要ありませんが、特殊なサンプルからライブラリー調製を行う場合、市販のリファレンス DNA / RNA がコントロールとして使用可能です。NEB のライブラリー調製キットの品質管理に使用しているリファレンスは以下などになります。

・DNA：Human NA19240 genomic DNA (Coriell #GM19240)

・RNA：Human Universal Reference RNA (Agilent #740000)

サンプルシートはどうやって設定すればよいですか?

基本的にはイルミナ社 Illumina Experimental Manager (IEM)を使用してシートを作成します。まずはデフォルト設定で仮シートを作成して保存、csv ファイルとして開いて NEB インデックス配列を記入します。インデックス配列は各キットのマニュアルをご参照ください。また IEM の使用方法につきましては、イルミナ社にお問合せください。