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10 周年:NEBNext 次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬
FAQ:よくある質問
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NEBNext の販売開始から 10 年を迎えました。現在では > 6,000 の査読雑誌や各国のシーケンスセンターで使用されています。これから NGS を始める方も、すでに解析を行っている方も、今後とも NEBNext をご愛用ください!

 

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Q1. キットの一部が先になくなってしまいました。単品で購入できますか?
Q2. 試薬に析出物(沈殿物)があるのですが、溶けません。
Q3. -20℃ 保存の試薬が凍結していました。使用できますか?
Q4. ライブラリーが良好にできているか否か、上手く判断できません。
Q5. ライブラリー収量が低いのですが、どうすればよいでしょうか?
Q6. 100 bp 前後にピークが観察されますが、大丈夫ですか? 
Q7. >1,000 bp 以上の高分子にピークがありますが、大丈夫ですか?
Q8. ライブラリーの波形がきれいなシングルピークではありません。
Q9. rRNA が上手く除去できていません。 
Q10. サンプルシートが作れません。
Q11. demultiplex ができません。

 

 

Q1. キットの一部が先になくなってしまいました。単品で購入できますか?
 

構成品は単品販売をしていませんが(一部除く)、反応毎にモジュールとして販売をしています(DNA モジュール、RNA モジュール)。 またインデックスキットの各プライマーも単品販売をしていません。 各キットのモジュールは DNA / RNA ライブラリー調製ページに掲載されています。


  ・DNA ライブラリー調製のモジュール

  ・RNA ライブラリー調製のモジュール


【NEBNext Ultra II DNA Kit, #E7645 の場合】

  ・NEBNext Ultra II End Repair/dA-tailing Module (酵素とバッファー)

  ・NEBNext Ultra II Ligation Module (酵素とエンハンサー)

  ・NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (酵素)


以下製品は単品販売を行っています。キットに含まれる量とは異なります。

  ・USER Enzyme(#M5505、S:50 ul、L:250 ul)

 
 
Q2. 試薬に析出物(沈殿物)があるのですが、溶けません。
 

NEBNext Ultra II FS DNA Kit (#E7805) に含まれる「Ultra II FS Reaction Buffer」など一部のバッファーでは、保存中に主にマグネシウムを主とする析出物を生じる場合があります。 この場合、ピペッティングで析出物をできる限り細かくして、ボルテックスします。この状態の上清をご使用ください。 仮に析出物が残存していても性能には影響ありません。

 
   
Q3. -20℃ 保存の試薬が凍結していました。使用できますか?
 

キット構成品の PCR マスターミックス(NEBNext Q5 Master Mix)など、一部の試薬は -20℃ で溶液状態ですが、冷凍庫で保管中、局所的/一時的に -20 ℃ よりも低温になった場合、凍結することがあります。 この凍結による酵素劣化はありませんので、ご安心してご使用ください。 なお使用する際はオンアイスで完全に融解してください。

 
   
Q4. ライブラリーが良好にできているか否か、上手く判断できません。
 

BioAnalyzer / TapeStationの結果(PDF データ)を添えて、弊社テクニカルサポートまでお尋ねください。 弊社見解を回答いたします。 以下情報も合わせていただくことにより、より正確な評価が可能となります。

 

  ・サンプルの由来 (例:マウス培養細胞)

  ・インプットの種類 (例:ゲノム DNA)

  ・インプットの精製方法 (例:A 社ゲノム精製カラム+RNase処理)

  ・ライブラリー調製に使用したインプット量 (例:100 ng、Nanodrop で定量)

  ・断片化サイズもしくは断片化時間 (例:200 bp、FS キットで15分間断片化)

  ・PCR サイクル数 (例:12 サイクル)

  ・ライブラリー濃度と定量方法 (例:10 nM、BioAnalyzer で定量)

 
   
Q5. ライブラリー収量が低いのですが、どうすればよいでしょうか?
 

NEB ライブラリー調製キットでは、30 - 100 nM(エンリッチメントの場合はこれ以上)のライブラリーが調製できます。これよりも低い場合、以下をご確認ください。


  ・インプット DNA / RNA の精製時、RNase / DNase 処理をしたか?  処理をしていない場合、DNA / RNA 濃度が実際よりも高く測定されて、ライブラリー調製最後の PCR サイクル数が本来よりも少なく設定されるため、ライブラリー収量が低下します。


  ・ インプット DNA / RNA の純度は問題ないか? 純度測定の際、吸光度系の 260 / 280 nm だけではなく、260 / 230 nm やスペクトル全体をご確認ください。 夾雑物の混入が示唆された場合、カラムやビーズなどで再精製をしてライブラリー調製を行います。 再精製が難しい場合、ライブラリー調製に使用するインプット量を低くして、調製系へのインプット溶液持ち込みを少なくします。


  ・BioAnalyzer / TapeStation などで定量をしている場合、適切に測定されているかをご確認ください。内部マーカーに対して目的ピークが高すぎる / 低すぎる場合、低く定量されることがありますので、ライブラリーの希釈や機器洗浄などを行ってから再測定をしてください。


  ・上記で改善しない場合、テクニカルサポートまでご連絡ください。その際、BioAnalyzer / TapeStation の測定データ(PDF)と Q4 回答欄にある情報を添えてお尋ねください。

 
 
Q6. 100 bp 前後にピークが観察されますが、大丈夫ですか?
 

アダプターダイマーもしくはプライマーの残存が考えられます。 特にアダプターダイマーはフローセルにハイブリダイズ、クラスタ―形成されて、シーケンスリードとして得られるため、シーケンス効率(データ量あたりのリード数)の低下を招きます。 そのため、これらダイマーの除去をしっかりと行うことが重要です。

 

・アダプターダイマー(125 bp 付近にピーク):再度ビーズ精製を行うことにより除去をします。またはアダプター濃度を下げて初めからライブラリー調製をします。

・プライマー残存(85 bp 付近にピーク):再度ビーズ精製を行うことにより除去をします


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Q7. >1,000 bp 以上の高分子にピークがありますが、大丈夫ですか?
 

下図のような波形の場合、PCR Artifact が生じたことが考えられます。 インプット量に対して PCR サイクル数が多すぎた場合、サイクル後期にプライマーが枯渇、P5/7 配列のアニールを介して非相補的 DNA 分子がバブル構造を形成することが原因です。 PCR サイクル数を減らして、再度ライブラリー調製を行うことにより改善が可能です。 あるいはメインピークに対して割合が低い場合(~10 % など)、そのままシーケンスをしても問題ありません。

 

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Q8. ライブラリーの波形がきれいなシングルピークではありません。
 

下図のような波形の場合、DNA あるいは RNA の断片化が不十分と考えられます。断片化時間を長くして、再度ライブラリー調製を行います。

 

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Q9. rRNAが上手く除去できていません。 
 

rRNA が除去できていない場合、以下をご確認ください。


  ・インプット RNA を精製する際、DNase 処理などによるゲノム DNA 除去を行っているか? もしゲノム DNA 除去をしていない場合、rRNA 除去最後の DNA プローブが分解されず、rRNA が残存しているような結果が観察されます。 この場合、ゲノム DNA 除去をしてから rRNA 除去をしてください。


  ・インプット RNA の量が多すぎないか? もし 1 ug 以上のトータル RNA を使用した場合、DNA プローブがすべてにハイブリダイズできず、rRNA が完全に除去できないことがあります。 この場合、1 ug 以下、できれば 100 ng などに量を減らして rRNA 除去を行ってください。


  ・DNA プローブのハイブリダイズのための温度はマニュアルどおりか? 95℃、2 分間で熱変性、続いて 0.1 ℃/秒でハイブリダイズをします。 もし熱変性時間が長い場合、あるいは温度低下が早い場合には、ハイブリダイズ効率が低下して、結果として rRNA 除去効率の低下を招きます。 設定を再確認してください。 また、あらかじめプログラムを開始して、95℃ になったタイミングで一時停止、その時にサンプルを入れてプログラムを再開始をすることをおすすめします。

 
 
Q10. サンプルシートが作れません。
 

基本的にはイルミナ社 Illumina Experimental Manager (IEM)を使用してシートを作成します。 まずはデフォルト設定で仮シートを作成して保存、csv ファイルとして開いて NEB インデックス配列を記入します。 インデックス配列は各キットのマニュアルをご参照ください。 また IEM の使用方法につきましては、イルミナ社にお問合せください。




Q11. demultiplexができません。
 

アダプター / インデックス キットの種類とシーケンサーの種類により、i5 インデックスの配列登録が異なります。 ご使用のキットのマニュアルをご参照ください。 もしシーケンス時のサンプルシート設定が間違っていた場合でも、シーケンス Raw データと正しい配列情報を使用して、各種解析ソフトで demultiplex が可能です。 また場合によっては配列の更新がありますので、最新のマニュアルをご確認ください。

 

【例:NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs)、#E6440】

 

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本製品に関するご質問は下記テクニカルサポートまでお問い合わせください。

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