新変異株に対応するため、VarSkip Short Primer をバージョンアップ (2022 年 3 月)
NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Library Prep Kit
本製品群は 新型コロナウイルス：SARS-CoV-2 の RNA ゲノムシーケンス用のライブラリー調製キットである。Nanopore と Illumina シーケンサーに対応した製品を提供している。ARTIC Network との共同研究の下、ARTIC SARS-CoV-2 プロトコール に基づいて開発された。RNA ゲノム全体をカバーするように各領域を逆転写・増幅して、そのアンプリコンから各社シーケンサーに対応するライブラリーを調製、次世代シーケンスにより全ゲノム解析を行う。これにより新型コロナウイルスの変異種の特定や新たな変異解析が可能となる。
特長：
・	新型コロナウイルスの全ゲノムシーケンス解析が可能（Nanopore / Illumina 対応）
・	ARTIC Network の協力によりプロトコール開発およびプライマー改良（ARTIC Network V3 primers と同じ配列）
・	ゲノムカバレッジと depth の均一性が大きく向上
・	10〜10,000 コピーのウイルスゲノム RNA から調製
・	インプット量によらない共通したプロトコール、cDNA 増幅時のノーマライズも不要
・	ヒト・コントロールプライマー、DNA 精製ビーズが付属
・	世界各国のシーケンスセンターや感染症研究所で採用　→　ユーザーボイス
・	デルタ株とオミクロンを含む新変異株により対応した VarSkip Short v2 Primer をキットに追加・バージョンアップ (一部除く)
・	New オミクロン株にも対応可能
・	ビーズ精製をスキップした Express プロトコールも公開

図 1：NEBNext ARTIC kit のワークフロー

A) RNA サンプルから逆転写反応により cDNA を合成、PCR により各領域を増幅する。ここまでは Illumina と Nanopore シーケンスで共通である。PCR で増幅したアンプリコンから、各社シーケンスに合わせたライブラリーを調製する。元々は Nanopore 用の ARTIC プロトコールが開発されたが、大量のサンプルのハイスループット解析のニーズなどにより、Illumina 用プロトコールが開発された。

B) 各フローの所要時間

図 2：独自のプライマーにより、ゲノム全体をカバーしたシーケンスが可能 (v3 primer)

オリジナルと NEBNext プロトコール (Nanopore 用、E7660)で 2 株の SARS-CoV-2 のゲノムシーケンスを実施、得られたリードをゲノムにマッピングして coverage と coverage depth を視覚化した。ARTIC オリジナルプロトコールでは SARS-CoV-2 ゲノムの一部の配列が取得されず、また coverage depth の偏りがあった。一方、NEBNext ARTIC では、ゲノムを完全にカバーしており、均一な coverage depth が取得されていることが示された。Illumina 用も同様の結果となっている。

図 3：新しく設計されたプライマーでオミクロン株の全ゲノム解析のカバレッジが向上 (VarSkip Short v2 Primer)

Integrative Genome Viewer visualization of read coverage across the SARS-CoV-2 genome (log scale). Amplicons were generated using NEBNext® VarSkip Short SARS-CoV-2 v2 primer pools, NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 primer pools, NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 primer pools (ARTICv3), MilliporeSigma ARTICv4 primer pools plus IDT ARTICv4.1 spike-in primers (ARTICv4.1), or MilliporeSigma ARTICv4 primer pools. The same Omicron variant SARS-CoV-2 viral gRNA clinical sample served as a template for all primer schemes except ARTICv3. Libraries were constructed using the NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina®) and sequenced on a MiSeq® instrument (2x75 bp). Coverage depth per base was determined, reads were down-sampled to 0.5M PE reads with seqtk and aligned to SARS-CoV-2 reference genome (NCBI, NC_045512) with Bowtie2.

[NCBI virus link to data]

図 4：オミクロン株にも対応 (VarSkip Short  v2 Primer)

Integrative Genome Viewer visualization of read coverage across the SARS-CoV-2 genome (log scale). Amplicons were generated using NEBNext® VarSkip Short SARS-CoV-2 v2 primer pools, NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 primer pools, NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 primer pools (ARTICv3), MilliporeSigma ARTICv4 primer pools plus IDT ARTICv4.1 spike-in primers (ARTICv4.1), or MilliporeSigma ARTICv4 primer pools. The same Delta variant SARS-CoV-2 viral gRNA clinical sample served as a template for all primer schemes except ARTICv3. Libraries were constructed using the NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina®) and sequenced on a MiSeq® instrument (2x75 bp). Coverage depth per base was determined, reads were down-sampled to 0.5M PE reads with seqtk and aligned to SARS-CoV-2 reference genome (NCBI, NC_045512) with Bowtie2.

[Information on primer overlaps with Omicron and Delta variants]

ARTIC Network とは：

Wellcome Trust 財団の⽀援によって設立・運営されている組織である。ARTIC（Advancing Real Time Infection Control）の名が示すように、ウイルスのサンプリング、核酸処理、シーケンス、データ解析などの情報やシステムを開発している。

これによりアウトブレイクから公衆衛生機関によるリアルタイムの疫学情報の取得まで、end-to-endに対応することを目的としている。これまでにエボラウイルスやジカウイルスなどの検出プロトコールを開発している。特に新型コロナ感染症対策においては、変異速度が速いSARS-CoV-2 ウイルスのゲノムシーケンスの基盤となる方法を開発、国立感染症研究所や世界各国の感染症センターで使用されている。

ARTIC Nextwork ホームページ

ARTIC SARS-CoV-2 プロトコールとは：

新型コロナウイルスの全ゲノムをシーケンスするためのプロトコールである。ゲノムの各領域から cDNA を合成、増幅したアンプリコンからライブラリーを調製してシーケンスする。オリジナルプロトコール^*1においては、Oxford Nanopore Technologies 社シーケンスでは 400 bp、Illumina 社シーケンスでは 150 bp（2 x 75 bp）または 400 bp（2 x 250 bp）のインサートサイズのライブラリーからリードを取得する。

*1 ARTIC SARS-CoV-2 プロトコール：Josh Quick 2020. nCoV-2019 sequencing protocol v2 (GunIt)

NEBNext ARTIC kits とは：

ARTIC SARS-CoV-2 プロトコールに基づいたライブラリー調製キットである。通常の NEBNext キットとは異なり、SARS-CoV-2 ウイルスゲノムの各領域を増幅するための専用プライマーが付属する。NEB 独自の改良によりゲノム全体のカバー率と coverage depth の均一性を向上、さらに 10－10,000 コピーからもライブラリーを調製できる。、Nanopore と Illumina シーケンサーに対応したキットを提供している。

USER Voice：

NEBNext ARTIC SARS-CoV- 2 Companion Kit（Oxford Nanopore Technologies）は、SARS-CoV-2 の Nanopore シーケンシングを実行するための最も便利な方法です。 ARTIC プロトコルを開発する際、Ct 33 未満のチャレンジングな臨床サンプルからゲノムシーケンスができるか否かに焦点を当てました。 そのために400 bp のアンプリコン・シーケンスを採用しました。 高 Ct や分解された RNA サンプルなど、様々なサンプル (RNA インプット) に対して、確実にシーケンスするためです。またサンプルへのバーコード・ワークフローは、逆多重化およびリファレンスベースのゲノムアッセンブルのためにフルサイズのアンプリコンを作成し、PCR フリーのライブラリー調製によりアンプリコン・コンタミネーションリスクを最小限に抑えます。 NEB と協力してプロトコルを最適化し、試薬の量を最小限に抑えながら性能向上に成功しました。 さらに、ゲノムの完全性を大幅に向上させ、読み取りカバレッジを削減するためにプライマープールも最適化しています。 96 バーコードキットとの互換性により、要件に応じて24〜96サンプルを柔軟に実行できます。

- Joshua Quick, Ph.D., バーミンガム大学 & ARTIC Network

私たちは NEBNext ARTIC FS kit の優れたパフォーマンスに感銘を受けました。 このキットを使用して、さまざまな質と量の SARS-CoV-2 RNA サンプルからのライブラリー調製をおこない、その感度とウイルスゲノムカバレッジの均一性に驚いています。さらにライブラリー調製の所要時間が極めて短いことは、私たちにとって本当に有益でした。

- Vladimir Benes, ゲノミクス部門長, 欧州分子生物学研究所（EMBL：European Molecular Biology Laboratory）

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit は、SARS-CoV-2 の全ゲノムを迅速かつ正確、さらに高い信頼性をもってシーケンスすることができます。その使いやすさにより、通常の NGS ワークフローへ迅速に統合することも可能です。 さらに、このキットは、困難な臨床サンプル（Ct > 30）でも堅牢に機能します。 NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit を 100％ お勧めします。

- Manuel Huter, Zams 病理学研究所 (オーストリア)

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シーケンスに関する論文集

COVID-19 研究関連試薬（RT-qPCRなど）

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