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| 概要 |
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分子クローニングとは組換え DNA 分子の作成を指し、生命科学の進歩の礎となっている技術である。その発端は 1970 年代の制限酵素の発見、つまり DNA 分子を選択的かつ特異的に切断する酵素にあり、リガーゼの発見や PCR の開発によって、用途と精巧さの両面において飛躍的な成長を遂げている。現在では遺伝子のクローニングは非常に簡単かつ効率的に行えるようになり、リガーゼを使った基本的なクローニング（Traditional Cloning）だけでなく、相同配列を使用した DNA アッセンブル（DNA Assembly：NEBuilder）、それに異なるプラスミド間で簡単に遺伝子をスワップできる方法（DNA Assembly・Golden Gate）などの次世代型クローニング（Seamless Cloning）も簡便かつ効率的な方法となっている。特に後者は合成生物学に該当する技術であるが、in silico で設計したあらゆる DNA コンストラクトを in vitro で化学合成できることを意味すると共に、DNA クローンの構築と組換えが迅速になり、遺伝子治療ベクターや組換えタンパク質生産プロセス、新しいワクチンの開発などに応用されている。
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| クローニング・ワークフロー |
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分子クローニングとは組換え DNA の作成を指すことを先述したが、得られたクローンは遺伝子配列の解析やその遺伝子がコードするタンパク質の発現、そのタンパク質の機能解析などに使用できる。またクローンに変異を導入することで、その遺伝子とタンパク質の機能解析にも応用できる。最も基本的なクローニングのワークフローとしては以下4 ステップになる。
1. 対象 DNA を単離する
2. 対象 DNA (インサート) をクローニングベクターに挿入し、リコンビナント分子 (プラスミド) を作成する
3. リコンビナントプラスミドを増幅ホスト (主に大腸菌) に形質転換する
4. 目的のリコンビナントプラスミドを持つホストをスクリーニング / セレクションする
それぞれの方法は1960 年後半から1970 年前半に開発され、その後の組み合わせと最適化によりこのようなワークフローが完成したのである。特に2 の工程では様々な方法が編み出させているが、現在では以下のような様々なクローニング・ワークフローがよく使用されている。
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図 3、代表的なクローニング・ワークフロー |
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| (1) |
Traditional Cloning (RE Digestion & Ligation) |
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目的 DNA とベクターをそれぞれ制限酵素で切断、その末端をライゲーションで連結して形質転換する方法である。DNA の切断においては、異なる突出末端を生じるために 2 種類の制限酵素がよく使用される。極めて基本的かつ王道的なクローニング方法であるが、クローニングサイトは制限部位に依存するため、DNA によっては自由度が低く、またクローン DNA には制限部位が残る。
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| (2) |
PCR Cloning |
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Traditional Cloning とよく似た方法だが、DNA インサートとして使用する PCR 産物を制限酵素で切断しない点が異なる。PCR 酵素の種類によってその末端形状が異なることを利用して (平滑末端もしくは 3'A 突出末端)、ベクターとライゲーションを行う。T/A クローニングもここに含まれる。一般的に長く使用されている実績があり、PCR 産物をそのまま使用できることが利点である。一方、平滑末端産物の場合にはクローニングの方向性が指定できないこと、3'A 末端の場合には専用の 5' T ベクターが必要なことが短所といえる。 |
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| (3) |
DNA Assembly (Seamless Cloning) |
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様々な酵素を使用して、配列に依存せず、シームレスに DNA をベクターに挿入する方法を指す。1 種類の DNA インサートだけではなく、複数のものも一度にアッセンブルできる点が特長である。方法に応じてインサートとベクターを準備しておくことが重要である。市販品としては NEBuilder、Gibson、Golden Gate、In-Fusion、GeneArt などが挙げられる。 |
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| (4) |
Ligatin Independent Cloning (LIC) |
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Traditional Cloning に代わりうる方法として 1990 年代に開発されたライゲーションを使用しない方法である。T4 DNA Polymerase の 3' → 5' エキソヌクレアーゼ活性を使用して、 長い 5' 突出末端を作成、それが強くアニーリングするため、ライゲーションをせずに形質転換ができる。計 4 箇所のニックは大腸菌内で修復される。配列によっては適用できないものがある。 |
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| (5) |
Recombinational Cloning |
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Integrase や Cre Recombinase などの部位特異的リコンビナーゼにの組換え反応に基づいた方法である。組換えに特異的な配列を有する DNA を準備することで簡単に連結や載せ替えができる。カタログ化された ORF が充実しており使いやすいものが多いが、特殊なベクターと酵素が必要なためにコストが高い。Gateway、Creator、Echo Cloning System が挙げられる。 |
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| NEB の主なクローニング・ワークフロー |
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代表的な 5 種類のクローニング方法のうち、NEB ではTraditional Cloning とDNA Assembly（Seamless Cloning）を主として用いている。それぞれのリンク先にて詳細を説明する.。
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| Traditional Cloning |
| 制限酵素と T4 DNA Ligase を主として使用する方法である。核酸精製から始まり、DNA 増幅 (PCR)、ベクターおよびインサートDNA 切断、リン酸化などの末端修飾、ライゲーション、形質転換、ポジティブクローンの確認の流れとなる。 |
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| DNA Assembly (Seamless Cloning) |
| 様々な酵素を使用した自由度と拡張性が高い方法である。3 種類の酵素を使用した NEBuilder HiFi Assembly と Type IIS 制限酵素を利用した Golden Gate Assembly について説明をする。各方法に適した DNA 準備をすることがポイントとなる。 |
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| クローニングを始める前に：成功のためのヒント |
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以下に Traditional Cloning と DNA Assembly にほぼ共通するクローニング成功のためのヒントを記す。どのような実験にも当てはまるが、事前計画を入念にすることで成功の確率が大きく上がる。
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| (1) |
しっかりと事前に計画を練る |
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材料のインサート DNA とベクターから目的クローンを得るための計画をする。目的に応じたクローニング方法の選定をおこない、その方法に即したプロトコールを作成する。どの方法であっても、インサートとベクターの連結部分、つまり末端形状に注意する (制限サイトの選定やプライマー設計など) 。タンパク質発現を最終目的とする場合はコドンフレームにも注意する。ホストの薬剤感受性とベクターの薬剤マーカーも十分確認しておく。 |
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| (2) |
コントロール |
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制限反応や形質転換など、基本的な反応であっても、コントロール反応を設ける。酵素などを入れないネガティブ・コントロールに加えて、可能であればその反応に推奨されるポジティブ・コントロールも行うとよい。コントロール反応を設けることにより、万が一予想と異なる結果が得られた場合であっても、速やかに原因解明と反応改善をすることができる。 |
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| (3) |
DNA 精製と使用量 |
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使用する DNA を十分に精製し、ヌクレアーゼや非特異的酵素活性が混入していないことを確認する。一般的には市販されている DNA 精製スピンカラムを用いる。精製途中で使用したフェノール、クロロホルム、エタノールなどが残存しないように注意する。また制限反応や PCR の阻害を防ぐため、塩を含まないバッファー中に DNA を保存する。各反応によって使用する DNA 量が異なるため、適切な DNA 量を確認する。制限反応の場合は0.2 ～ 1.0 μg であり、PCR の場合には数ng で十分である。 |
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| (4) |
制限酵素によるDNA 切断 |
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下流の実験に合わせて反応容量を設定する。例えば電気泳動解析を行う場合にはアプライ量を基準に設定する。多くのクローニングにおいては20 ～50 μl を使用する。反応に使用する制限酵素は全容量の10％以下とし、スター活性を防ぐためにグリセロール濃度が5％以下となるようにする。またPCR産物はできる限り精製をしてから切断をする。 |
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| (5) |
末端処理 |
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制限処理したDNA 末端には5´ リン酸、3´OH 基が付加されているため、そのままライゲーションに使用できる。ただし末端形状があっていない場合には平滑化などを行う必要がある。Taq DNA Polymerase（NEB #M0273）のPCR産物は3´A である。Q5 DNA Polymerase（NEB #M0491）のような高正確性ポリメラーゼのPCR産物は平滑末端を生じる。ポリメラーゼによって産物の形状が異なることに留意する。一般的に市販されているプライマーはリン酸化されていないため、PCR 産物は5´ リン酸化されない。脱リン酸化したベクターにライゲーションする場合、5´ リン酸化プライマーを用いてPCR を行うか、Kinase でPCR 産物をリン酸化する必要がある。 |
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| (6) |
ライゲーション前のDNA 精製 |
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ベクターおよびインサートを電気泳動あるいはカラムで精製する。この操作により未切断のベクターや非特異的PCR 産物などを取り除き、ライゲーション効率が向上できる。まず切断したDNA をアガロースゲルで確認する。もし切断DNA がシングルバンドを示すようであれば、カラム精製を行う。複数のバンドを示すのであれば、モナーク・ゲル抽出キット（NEB#T1020）やβ-Agarase I（NEB #M0392）を使用してゲルを切り出して精製を行う。この際、長波長（365 nm）の紫外線を使用してDNA分解を最小限に留める。 |
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| (7) |
DNA 定量 |
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下流の実験に最適なDNA 量を使用するため、電気泳動か吸光度系（NanoDrop など）にて定量を行う。クローニング・テクニカルガイド 43 ～ 49 ページのDNA 定量（核酸濃度、純度測定）を参照する。 |
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(8)
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ライゲーション |
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使用するリガーゼのガイドラインに従って反応を行う。もしインサート：ベクター = 3：1 のモル比が推奨されている場合、これを用いるとよい。これはモル比であって質量比でないことに注意する。オンラインツール：NEBioCalculator を使用して計算するとよい。通常のクローニングでは短時間でライゲーション反応が進行するが、ライブラリー作製などでは反応時間を延長する。 |
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(9)
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コンピテントセル |
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自作のコンピテントセルは市販されているものよりも形質転換効率が低いことが多い。市販されているコンピテントセルを使用することで、結果として時間短縮、サンプルロスの回避、成功率向上が可能となる。 |
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| (10) |
確認 |
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コロニーPCR を行う場合、クルードサンプルに適したPCR ポリメラーゼを使用する。 |
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| オンラインツール |
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NEB では分子生物学研究に汎用的に使用できるものから、あるクローニング方法に専用のものに至るまでのオンラインツールを公開している。以下に代表的ものを挙げる。
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| NEB All Online Tools |
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クローニングテクニカルガイド  |
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