 |
|
|
|
DNA Assemblyとは色々な種類と数の DNA をつなぎ合わせることであり、近年では合成生物学の根幹をなす技術である。制限酵素と T4 DNA Ligase を鍵酵素として使用する Traditional Cloning とは異なり、制限酵素部位に依存することなく自由に組換えプラスミド DNA を構築でき、短時間かつ高効率でクローニングができるため、次世代型クローニングともいえる。さらに連結部分も自由に設定できるため、Seamless Cloning (シームレス・クローニング) とも呼ばれる。DNA Assembly (Seamless Cloning) にはいくつかの方法があるが、共通する特長は以下になる。 |
|
・制限酵素部位に依存することなく、自由にインサート DNA をベクターに挿入できる (自由に組換えプラスミドが作成できる)
|
・複数断片でも同時にクローニングできる |
・インサート DNA を PCR で増幅した際、その産物を制限酵素で切断しておく必要がない
|
・1 本鎖 DNA もクローニングできる (NEBuilder の場合) |
・クローニング時間が短い
|
|
DNA Assembly の開発の歴史を見ると、Type IIS 制限酵素を用いる方法が初めに開発された。これを発展したものが NEB Golden Gate Assembly である。また T5 エキソヌクレアーゼと高熱性ポリメラーゼ、Taq DNA Ligase を組み合わせた Gibson Assembly (これを発展させたものがNEBuilder) や、強い 3'→5´エキソヌクレアーゼ活性を持つ DNA ポリメラーゼを用いた In-Fusion 法、大腸菌の祖抽出液を使用するだけの SliCE 法など、現在では様々な方法がある。ここでは NEBuider と Golden Gate Assembly 法に焦点を当てる。
|
|
DNA Assembly はその方法によってワークフローが異なるが、大まかに言えば以下のようになる。すなわち、アッセンブル方法に関わらず、事前の DNA 準備が必要である。ただし方法によって準備方法が異なるため、各方法に適した準備を行う。
|
|
DNA Assembly Workflow |

|
|
|

|
|
NEB DNA Assembly Kits |
|
 |
T5 エキソヌクレアーゼと高熱性ポリメラーゼ、Taq DNA Ligase を用いて相同配列を付加した DNA を連結する方法である。効率と拡張性が高い。
|
|
|
 |
Type IIS の制限酵素とT4 DNA リガーゼを使用するアッセンブル法。複数のプラスミドソースからのコンストラクト作成に効果的。
|
|
|
 |
Coming soon.
|
|
|
 |
Comming soon.
|
|
|
NEB DNA Assembly 選択チャート |
|
NEBuilder
#E2621
#E5520
#E2623
|
Gibson
#E2611
#E5510
|
Golden Gate
#E1601
#E1602
|
特長 |
5´ および 3´ 末端のミスマッチ除去 |
★★★ |
★ |
N/A |
連結部分の正確性 |
★★★ |
★★ |
★★★ |
連結部分にリピート配列がある場合 |
★ |
★ |
★★★ |
完全連結 (ニックがない) |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
1 本鎖 DNA と 2 本鎖 DNA の連結 |
★★★ |
★★ |
NR |
微量 DNA のアッセンブリ |
★★★ |
★★ |
★★ |
オーバーラップ配列の柔軟性 |
★★★ |
★★★ |
★ |
アプリケーション |
2 断片のアッセンブル (インサート DNA とベクター) |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
3 ~ 6 断片のアッセンブル |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
7 ~ 11 断片のアッセンブル |
★★★ |
★★ |
★★★ |
12 ~ 35 断片のアッセンブル(1) |
★ |
★ |
★★★ |
In vitro 翻訳のテンプレート調製 |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
全ゲノムの人工構築 |
★★★ |
★ |
★★★ |
部位特異的変異導入(複数) |
★★★ |
★★ |
★★ |
クローンライブラリーの調製 |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
代謝経路のエンジニア |
★★★ |
★★ |
★★★ |
TALENs |
★★ |
★★ |
★★★ |
短鎖ヘアピン RNA のクローニング (shRNA) |
★★★ |
★★ |
★ |
ゲノム RNA のクローンライブラリー調製 |
★★★ |
★★ |
★ |
大きなサイズの DNA のクローニング (> 10 kb) |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
小さいサイズのDNA のクローニング (< 100 bp) |
★★★ |
★ |
★★★ |
制限部位の消失 |
★★★ |
★ |
NR |
|
|