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DNA Assembly

(Seamless Cloning)

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DNA Assemblyとは色々な種類と数の DNA をつなぎ合わせることであり、近年では合成生物学の根幹をなす技術である。制限酵素と T4 DNA Ligase を鍵酵素として使用する Traditional Cloning とは異なり、制限酵素部位に依存することなく自由に組換えプラスミド DNA を構築でき、短時間かつ高効率でクローニングができるため、次世代型クローニングともいえる。さらに連結部分も自由に設定できるため、Seamless Cloning (シームレス・クローニング) とも呼ばれる。DNA Assembly (Seamless Cloning) にはいくつかの方法があるが、共通する特長は以下になる。
 

・制限酵素部位に依存することなく、自由にインサート DNA をベクターに挿入できる (自由に組換えプラスミドが作成できる)

・複数断片でも同時にクローニングできる

・インサート DNA を PCR で増幅した際、その産物を制限酵素で切断しておく必要がない

・1 本鎖 DNA もクローニングできる (NEBuilder の場合)

・クローニング時間が短い


DNA Assembly の開発の歴史を見ると、Type IIS 制限酵素を用いる方法が初めに開発された。これを発展したものが NEB Golden Gate Assembly である。また T5 エキソヌクレアーゼと高熱性ポリメラーゼ、Taq DNA Ligase を組み合わせた Gibson Assembly (これを発展させたものがNEBuilder) や、強い 3'→5´エキソヌクレアーゼ活性を持つ DNA ポリメラーゼを用いた In-Fusion 法、大腸菌の祖抽出液を使用するだけの SliCE 法など、現在では様々な方法がある。ここでは NEBuider と Golden Gate Assembly 法に焦点を当てる。


DNA Assembly はその方法によってワークフローが異なるが、大まかに言えば以下のようになる。すなわち、アッセンブル方法に関わらず、事前の DNA 準備が必要である。ただし方法によって準備方法が異なるため、各方法に適した準備を行う。

 

DNA Assembly Workflow

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NEB DNA Assembly Kits

 

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T5 エキソヌクレアーゼと高熱性ポリメラーゼ、Taq DNA Ligase を用いて相同配列を付加した DNA を連結する方法である。効率と拡張性が高い。

 
 
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Type IIS の制限酵素とT4 DNA リガーゼを使用するアッセンブル法。複数のプラスミドソースからのコンストラクト作成に効果的。

 
 
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Coming soon.

 
 
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Comming soon.

 
 
 NEB DNA Assembly 選択チャート
 

NEBuilder

#E2621

#E5520

#E2623

Gibson

#E2611

 #E5510

Golden Gate

#E1601

#E1602

 特長
 5´ および 3´ 末端のミスマッチ除去 ★★★ N/A
 連結部分の正確性 ★★★ ★★ ★★★
 連結部分にリピート配列がある場合 ★★★
 完全連結 (ニックがない) ★★★ ★★★ ★★★
 1 本鎖 DNA と 2 本鎖 DNA の連結 ★★★ ★★ NR
 微量 DNA のアッセンブリ ★★★ ★★ ★★
 オーバーラップ配列の柔軟性 ★★★ ★★★
 アプリケーション
 2 断片のアッセンブル (インサート DNA とベクター) ★★★ ★★★ ★★★
 3 ~ 6 断片のアッセンブル ★★★ ★★★ ★★★
 7 ~ 11 断片のアッセンブル ★★★ ★★ ★★★
 12 ~ 35 断片のアッセンブル(1) ★★★
 In vitro 翻訳のテンプレート調製 ★★★ ★★★ ★★★
 全ゲノムの人工構築 ★★★ ★★★
 部位特異的変異導入(複数) ★★★ ★★ ★★
 クローンライブラリーの調製 ★★★ ★★★ ★★★
 代謝経路のエンジニア ★★★ ★★ ★★★
 TALENs ★★ ★★ ★★★
 短鎖ヘアピン RNA のクローニング (shRNA) ★★★ ★★
 ゲノム RNA のクローンライブラリー調製 ★★★ ★★
 大きなサイズの DNA のクローニング (> 10 kb) ★★★ ★★★ ★★★
 小さいサイズのDNA のクローニング (< 100 bp) ★★★ ★★★
 制限部位の消失 ★★★ NR
 

 

 

DNA アッセンブリ & 合成生物学 image  
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