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| DNA Assemblyとは色々な種類と数の DNA をつなぎ合わせることであり、近年では合成生物学の根幹をなす技術である。制限酵素と T4 DNA Ligase を鍵酵素として使用する Traditional Cloning とは異なり、制限酵素部位に依存することなく自由に組換えプラスミド DNA を構築でき、短時間かつ高効率でクローニングができるため、次世代型クローニングともいえる。さらに連結部分も自由に設定できるため、Seamless Cloning (シームレス・クローニング) とも呼ばれる。DNA Assembly (Seamless Cloning) にはいくつかの方法があるが、共通する特長は以下になる。 |
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・制限酵素部位に依存することなく、自由にインサート DNA をベクターに挿入できる (自由に組換えプラスミドが作成できる)
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| ・複数断片でも同時にクローニングできる |
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・インサート DNA を PCR で増幅した際、その産物を制限酵素で切断しておく必要がない
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| ・1 本鎖 DNA もクローニングできる (NEBuilder の場合) |
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・クローニング時間が短い
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DNA Assembly の開発の歴史を見ると、Type IIS 制限酵素を用いる方法が初めに開発された。これを発展したものが NEB Golden Gate Assembly である。また T5 エキソヌクレアーゼと高熱性ポリメラーゼ、Taq DNA Ligase を組み合わせた Gibson Assembly (これを発展させたものがNEBuilder) や、強い 3'→5´エキソヌクレアーゼ活性を持つ DNA ポリメラーゼを用いた In-Fusion 法、大腸菌の祖抽出液を使用するだけの SliCE 法など、現在では様々な方法がある。ここでは NEBuider と Golden Gate Assembly 法に焦点を当てる。
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DNA Assembly はその方法によってワークフローが異なるが、大まかに言えば以下のようになる。すなわち、アッセンブル方法に関わらず、事前の DNA 準備が必要である。ただし方法によって準備方法が異なるため、各方法に適した準備を行う。
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| DNA Assembly Workflow |
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| NEB DNA Assembly Kits |
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T5 エキソヌクレアーゼと高熱性ポリメラーゼ、Taq DNA Ligase を用いて相同配列を付加した DNA を連結する方法である。効率と拡張性が高い。
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Type IIS の制限酵素とT4 DNA リガーゼを使用するアッセンブル法。複数のプラスミドソースからのコンストラクト作成に効果的。
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Coming soon.
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Comming soon.
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| NEB DNA Assembly 選択チャート |
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NEBuilder
#E2621
#E5520
#E2623
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Gibson
#E2611
#E5510
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Golden Gate
#E1601
#E1602
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| 特長 |
| 5´ および 3´ 末端のミスマッチ除去 |
★★★ |
★ |
N/A |
| 連結部分の正確性 |
★★★ |
★★ |
★★★ |
| 連結部分にリピート配列がある場合 |
★ |
★ |
★★★ |
| 完全連結 (ニックがない) |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
| 1 本鎖 DNA と 2 本鎖 DNA の連結 |
★★★ |
★★ |
NR |
| 微量 DNA のアッセンブリ |
★★★ |
★★ |
★★ |
| オーバーラップ配列の柔軟性 |
★★★ |
★★★ |
★ |
| アプリケーション |
| 2 断片のアッセンブル (インサート DNA とベクター) |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
| 3 ～ 6 断片のアッセンブル |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
| 7 ～ 11 断片のアッセンブル |
★★★ |
★★ |
★★★ |
| 12 ～ 35 断片のアッセンブル（1） |
★ |
★ |
★★★ |
| In vitro 翻訳のテンプレート調製 |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
| 全ゲノムの人工構築 |
★★★ |
★ |
★★★ |
| 部位特異的変異導入（複数） |
★★★ |
★★ |
★★ |
| クローンライブラリーの調製 |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
| 代謝経路のエンジニア |
★★★ |
★★ |
★★★ |
| TALENs |
★★ |
★★ |
★★★ |
| 短鎖ヘアピン RNA のクローニング (shRNA) |
★★★ |
★★ |
★ |
| ゲノム RNA のクローンライブラリー調製 |
★★★ |
★★ |
★ |
| 大きなサイズの DNA のクローニング (> 10 kb) |
★★★ |
★★★ |
★★★ |
| 小さいサイズのDNA のクローニング (< 100 bp) |
★★★ |
★ |
★★★ |
| 制限部位の消失 |
★★★ |
★ |
NR |
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