PURExpress delta Ribosome Kit
カタログ番号 |
サイズ |
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E3313S | 10 reactions | ¥65,000 | -80C |
製品カテゴリ>グループ
- タンパク質発現&精製>PURExpress (無細胞タンパク質合成システム)
備考
- 備考:価格改定 (2023年4月1日)
特徴
2016年10月 毒物指定解除 (詳細)
特徴:
・ わずか2時間でタンパク質合成が完了
・ リボソームが別チューブで付属
・ T7プロモーター保有の鋳型DNAを使用
- PCR産物およびプラスミドを鋳型として使用可能
・ 高い収量
- CBB染色で確認可能な合成レベル
・ 簡単な精製
- カラムとレジンでタグ無しの目的タンパク質を簡単に精製
・ 転写/翻訳因子以外が含まれていないクリーンなシステム
- プロテアーゼなどによるサンプルの分解が最小限
・ 正確なS-S結合の形成が可能(PURExpress® Disulfide Bond Enhancer(E6820S)と併用時、別売)
概要:
PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kitは短時間で遺伝子発現が可能な無細胞タンパク質合成キットであり、大腸菌由来の翻訳因子を個別に調製・精製したものを再構成したIn vitro転写/翻訳システムである。システムに含まれる酵素はすべてHisタグが付加されたリコンビナント酵素であり、aminoacyl-tRNA synthetases (20)、initiation factors (3)、elongation factors (3)、release factors (3)、ribosome recycling factor、methionyl-tRNA transformylase、T7 RNA polymerase、creatine kinase、myokinase、nucleoside-di-phosphate kinaseおよびpyrophophataseによって転写/翻訳に必要な活性およびエネルギーが生産される。また、これらの酵素以外に精製70Sリボソームやアミノ酸、rNTP、tRNAが含まれている。
PURExpress ΔRibosome Kitは2種類の反応溶液(リボソームを含まない)とリボソーム溶液から構成されいる。
PURExpress Disulfide Bond Enhancer(E6820S)と併用すれば、in vitroで正確なS-S結合を形成し、タンパク質を正しくフォールディングすることができる。その結果、生理的活性を有するタンパク質、可溶性のタンパク質の合成量が向上する。
PURExpressは東京大学の上田卓也博士によって開発されたPURE System(BioComber, Tokyo, Japan)をベースに開発したものである。使い方も非常に簡便であり、2種類の反応液とテンプレートDNAを混ぜるだけのワンステップ反応でタンパク合成を行うことが可能である(図1)。多くの場合、反応時間はわずか2時間で十分である。合成したタンパク質はSDS-PAGE(CBB染色、35S-ラベル化タンパクのオートグラフィー、ウェスタンブロット)で確認することが可能であり(図2)、あるいは反応液をそのまま使用して酵素活性を確認することも可能である。さらに高分子選択フィルタースピンカラムを使用して高分子であるリボソームを取り除いた後、IMAC (immobilized metal affinity chromatography; Niカラムなど)カラムに供して合成因子を除去することで合成タンパクを精製することができる(図1)。
本キットに含まれる転写/翻訳に関与する酵素はすべてリコンビナントから精製されているため、エキソヌクレアーゼやRNase、プロテアーゼなどの夾雑物を含んでいない。このためテンプレートDNAや合成タンパク質を分解することはほとんどない。またタンパク修飾因子も含まれていないため、合成タンパクは糖鎖付加やリン酸化など一切修飾されない。
図1 PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kitによるタンパク質合成例
25 μl反応溶液中(20 units RNase Inhibitorを添加)において、250 ngのテンプレートDNAから37℃で2時間タンパク質合成をおこなった。合成終了後、各反応液2.5 μl をSDS-PAGE(10-20% Tris-glycineゲルを使用)に供した。図中の赤丸は合成されたタンパク由来のバンドを示す。Marker MはNEBのProtein Ladder (NEB #P7703)を使用した。
図2 35S-メチオニンの取り込み合成
25 μlの反応溶液中、250 ngのテンプレートDNA、20 unitsのRNase Inhibitorと2 μlの 35S-metを加えて、37℃で2時間合成を行った。各反応溶液2.5 μlをSDS-PAGEに供した。ゲルを10分間固定した後、80℃で2時間乾燥をおこない、-80℃において5時間、X線フィルムへ暴露させた。
図3 PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kitの操作手順
上段:T7プロモーターを有する鋳型DNA(プラスミド/ PCR産物)と2種類の反応液を勘合し、37℃で2時間インキュベート
下段:スピンカラムおよびニッケルレジンにより、余分な因子を除去し、目的タンパク質を精製
図4 DHFR (A)およびT4 DNA Ligase (B)の合成と精製
PURExpressを用いてそれぞれのタンパク質の合成をおこなった。合成反応はマニュアルにしたがって、全容量125 μl中にておこなった。反応後、10–20% Tris-glycine グラジエントゲルを用いたSDS-PAGEに供し、Coomassie Blueによって染色した。結果、合成後溶液中においても目的タンパク質のバンドが確認された(Lane Total protein)。さらに、スピンカラムおよびNiカラムを用いることにより簡単に精製ができることが示された(Lane Ni-NTA flow through)。なお、図中の赤丸は目的タンパク質のバンドを示す。
Marker MはProtein Ladder (NEB #P7703)を用いた。
アプリケーション:
・ タンパク質の簡易かつ迅速な合成と下流実験への応用
・ オープンリーディングフレイム(ORF)の確認
・ ORF中の変異効果の確認
・ 活性ドメインや機能性アミノ残基決定のためのトランケートタンパク質の合成
・ 修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、標識アミノ酸を取り込んだタンパク質の合成
・ エピトープマッピング
・ 毒性タンパク質の合成
・ リボソームディスプレイ
・ 翻訳やフォールディング研究
・ In vitro compartmentalization
キット内容:
・Solution A
・Factor Mix
・E.coli Ribosome
・Control (DHFR) template (10 μl)
プロトコール
保存条件
保存温度:
-80°C
メモ
- DHFR control templateの濃度は125 ng/µlである。コントロール反応に使用する場合には2 µlを使用する。
- テンプレートDNAに関して、特にミニプレップ(Qiagen社製品など)でプラスミドDNAを調製した場合、RNaseが混入する場合があるため、その際は合成反応系に20 unitsのMurine RNase Inhibitor (NEB #M0314)を加えることを推奨する。
- 反応をセットアップする際にはSolution BをSolution Aに加える。Solution Bを希釈しない。
- 効率的な合成を行うために、テンプレート濃度の条件検討が必要であるが、多くの場合はプラスミドDNAをテンプレートとして用いた際に250 ng(全反応容量25 ul中)が適していることから、これを基準として検討を行うこと。 最適濃度の検討には25–250 ngの範囲が有効である。
- PURExpress Disulfide Bond Enhancer(E6820S)と併用すれば、in vitroで正確なS-S結合を形成し、タンパク質を正しくフォールディングすることができる。
参考文献
- Asahara, H. and Chong, S. (2010) In vitro genetic reconstruction of bacterial transcription initiation by coupled synthesis and detection of RNA polymerase holoenzyme. Nuc. Acid. Res, doi:10.1093/nar/gkq377.
- Noto, T., Kurth, H., Kataoka, K., Aronica, L., DeSouza, L., Siu, K., Pearlman, R., Gorovsky, M. and Mochizuki, K. (2010) The tetrahymena argonaute-binding protein Giw1p directs a mature argonaute-siRNA complex to the nucleus. Cell, 140, 692-703.
- Tanner, D., Cariello, D., Woolstenhulme, C., Broadbent, M. and Buskirk, A. (2009) Genetic identification of nascent peptides that induce ribosome stalling. J. Biol. Chem, 284, 34809-34818.
- Talabot-Ayer, D., Lamacchia, C., Gabay, C., and Palmer, G. (2009) Interleukin-33 is biologically active independently of Caspase-1 cleavage. J. Biol. Chem, 284, 19420-19426.
- Feng, Y. and Cronan, J. E. (2009) A new member of the Eschericia coli fad regulon: transcriptional regulation of fadM (ybaW). J. Bacteriol, 191, 6320-6328.
- Solaroli, N., Panayiotou, C., Johansson, M., and Karlsson, A. (2009) Identification of two active functional domains of human adenylate kinase 5. FEBS Lett, 283, 2872-2876.
関連製品
・PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit : スタンダードなタンパク質合成キット
・PURExpress Disulfide Bond Enhancer : ジスルフィド結合の形成を促進し、タンパク質を正しくフォールディングするエンハンサー
・PURExpress Δ (aa, tRNA) kit : アミノ酸およびtRNAが別チューブに含まれるキット
・PURExpress Δ RF123 kit : 解離因子RF123が別チューブに含まれるキット
Legal
Licenses/Patents/Disclaimers:
PURExpress® is based on the PURE System Technology originally developed by Dr. Takuya Ueda at the University of Tokyo and commercialized as the PURESYSTEM® by BioComber (Tokyo, Japan).
Licensed from BioComber (Tokyo, Japan) under Patent Nos. 7,118,883; WO2005-105994 and JP2006-340694. For research use only. Commercial use of PURExpress® Δ Ribosome Kit requires a license from New England Biolabs, Inc.