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K. lactis Protein Expression Kit

K. lactis Protein Expression Kitカタログ番号:E1000

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E1000S 1 kit ¥150,000 -20C / -80C

製品カテゴリ>グループ

  • タンパク質発現&精製>K.lactis(酵母)発現システム

特徴

発現タンパク質を細胞外に分泌、培地上清から精製できる酵母発現システム
   
特長:  
・大腸菌に毒性を示す遺伝子のクローニングや発現 
・発現タンパク質は細胞外に分泌、培養上清から簡単に精製 

・複数コピーの遺伝子を同時に発現

・抗生物質やメタノールは不要 
・酵母初心者でも簡単なプロトコール 
・企業ライセンスあり  
   

説明:

酵母 Kluyveromyces lactis を使用したタンパク質発現キットである。発現ベクターである pKLAC2 ベクターは、目的遺伝子が α-接合因子の分泌ドメイン(α-MF)の下流にクローニングされるようにデザインされており、発現タンパク質は細胞外に分泌されるため、細胞破砕することなく培養上清から精製ができる。このほか、大腸菌発現や他の酵母発現と比較して以下の利点がある。

 

  大腸菌に毒性を示すタンパク質の発現
  複数の発現カセットのゲノム相同組換えと K.lactis の高密度培養による高収量発現
  2 種類以上のタンパク質の共発現
  発現カセットが K. lactis のゲノム内に組み込まれるため、安定発現株として使用
  ポジティブクローン・セレクションにはアセトアミドを使用、メタノールや抗生物質は不要
  細胞外分泌プロセスにおいて発現タンパク質がフォールディングおよび修飾(主に糖鎖付加)

 

K.lactis のタンパク質発現および細胞外分泌プロセス
1) 発現カセットのゲノム相同組換え (Nucleus)
  pKLAC2 発現ベクターの発現カセットがゲノムに相同組換えされる。図中、水色部分がα-Mating Factor(MF)を示す。
2) タンパク質発現と小胞体輸送(ER)
  α-MF ドメインと目的タンパク質が融合して発現。α-MF中のシグナルペプチドにより小胞体(ER)に移行され、シグナルペプチダーゼ(SP)により切断される。 
3) ゴルジへの輸送とα-MFの切断(Golgi)
 

発現タンパク質がゴルジに輸送され、そこに存在するKexプロテアーゼがα-MFを切断する。

4) 細胞外分泌(Secreted Protein)
  発現タンパク質が細胞外に分泌される。これらのプロセス中、酵母自体の機能によりフォールディングと糖鎖付加が行われる。
 image

 

K.lactis におけるタンパク質発現と細胞外分泌:
 image

マルトース結合タンパク質(MBP、42.5 kDa)をK.lactis で発現させたところ、培養上清に分泌されたことが示された。高ペプトン培地で培養、発現後の培養上清の 15 µl を SDS-PAGE に供して CBB 染色で検出した。


 Lane 1:プロテインマーカー

 Lane 2:培養上清(野生株、未発現)

 Lane 3:培養上清(GG799 株、MBP 発現)


発現タンパク質の収量と分泌量は、タンパク質の種類と培養条件によって異なるが、>10 mg/l の場合に SDS-PAGE でバンドとして検出できる。分泌量が少ない場合、限外ろ過で濃縮するか、ウェスタンブロットで検出する。

キット内容

・pKLAC1-malE Control Plasmid

・pKLAC2 Vector

・SacII

・Integration Primer 1

・Integration Primer 2

・Integration Primer 3

・NEB Yeast Transformation Reagent (5 ml)

・Acetamide solution (sterile) (10 ml)

・NEBuffer 4

・K. lactis GG799 Competent Cells

・Yeast Medium Pack