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ProtoScript II Reverse Transcriptase

ProtoScript II Reverse Transcriptaseカタログ番号:M0368

カタログ番号

サイズ

濃度

価格(税別)

保存温度

M0368S 4,000 units 200,000 units/ml ¥14,400 -20C
M0368L 10,000 units 200,000 units/ml ¥28,800 -20C
M0368X 40,000 units 200,000 units/ml ¥102,600 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • ポリメラーゼ&増幅技術>逆転写酵素&RT-PCRキット
  • RNA研究用試薬>逆転写酵素およびRT-PCR

備考

  • 備考:価格改定 (2023年4月1日)

特徴

【お知らせ】 2013年6月24日より製品名が変更されました。旧製品名は「M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)」です。 

製品内容、製品番号、希望小売価格に変更はありません。

 

 

高収量かつ高感度なRNase H-(マイナス)型逆転写酵素

■ RNase H活性を低減
■ 高収量かつ高感度を実現
■ 高温での逆転写反応が可能 (~50℃)
■ 長鎖cDNAの合成にも最適 (~12kb)
■ 次世代シーケンシング用のmRNAライブラリー調製に最適

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説明:
ProtoScript II Reverse Transcriptaseは、M-MuLV reverse transcriptase に変異を加えることで、RNase Hの活性を減少させ、高温での安定性を増した逆転写酵素である。野生型のM-MuLV reverse transcriptaseより高い反応温度で第一鎖cDNA合成をするのに用いることができる。この酵素は50℃まで活性を有し、cDNAをより高い特異性と収量で合成し、全長のcDNAをより多く合成する (12 kbまで)。

 

由来:

M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H) をコードする遺伝子を大腸菌ないで発現し、単一になるまで精製。

 

付属試薬:

・DTT (10X)
・M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H) Reaction Buffer (5X)

 

熱による不活性化:

65℃で20分間

 

 

関連製品:
・Deoxynucleotide Solution Mix (N0447)
Oligo d(T)23VN (S1327S)
Random Primer6 (S1230S)
Random Primer Mix (S1330S)
RNase Inhibitor, Murine(M0314)
RNase H(M0297)

・ProtoScript II First cDNA Synthesis Kit (E6560S/L)

 

 

ProtoScript II Reverse Trascriptaseは他社のRNase H-の逆転写酵素と同等の性能を有する
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Jurkat細胞のトータルRNA (1 μg)を20 μlの第一鎖cDNA合成に用いた。逆転写酵素を除く全反応液をそれぞれの温度で3分間インキュベーションした。ついで、200 unitsのSuperScript® II (A) もしくは、 ProtoScript II Reverse Transcriptase(B)を加え、それぞれの温度で50分間反応させたのち、80℃で5分間熱失活を行った。1 μl の cDNA を 25 μlのPCR反応(LongAmp Taq Master Mix (NEB #M0533)を用いて35-40 サイクル増幅)に用いた。L は 2 Log DNA Ladder (NEB #N0469)。

 

 

長鎖のテンプレートでも力強いcDNA合成
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Jurkat細胞のトータルRNA (1 μg)を200 unitsのProtoScript II Reverse Transcriptaseを含む20 μl反応液で第一鎖cDNA合成に用いた。反応は42℃で50分間行い、ついで、80℃で5分間熱失活を行った。1 μl の cDNA を 25 μlのPCR反応(LongAmp Taq Master Mix (NEB #M0533)を用いて35-40 サイクル増幅)に用いた。増幅長はゲルの上部に示す。L は 2 Log DNA Ladder (NEB #N0469).

 

 

微量RNAサンプルからでも確実にcDNAの合成が可能
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1 pg ~ 1 μg のJurkat細胞のトータルRNA を200 unitsのProtoScript II Reverse Transcriptaseを含む20 μl反応液で第一鎖cDNA合成に用いた。反応は42℃で50分間行い、その後80℃で5分間熱失活を行った。1 μl の cDNA を 25 μlのPCR反応(LongAmp Taq Master Mix (NEB #M0533)を用いて40 サイクル増幅)に用いた。ターゲットは0.6kbのGAPDHの断片。L は 2 Log DNA Ladder (NEB #N0469)。

 

 

ProtoScript II Reverse Transcriptase は高感度
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1 ngのJurkat細胞のトータルRNA存在下で (102~109) 分子のルシフェラーゼのmRNAを、 50 unitsのM-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-) を含む20 μlの反応液でcDNAを合成した。1/20のcDNA産物を、SsoAdvanced SYBR® Green Supermixを用いて増幅。5分子のルシフェラーゼmRNAを検出できた。

反応条件と保存条件

反応条件:

1X M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H) Reaction Buffer
必要に応じて10XDTTを加える
42℃でインキュベーション

 

1X ProtoScript II Reverse Transcriptase Reaction Buffer:

・50 mM Tris-HCl
・75 mM KCl
・3 mM MgCl2
pH 8.3 @ 25°C

 

ユニット定義:

1 unitは、poly(rA)・oligo(dT)をテンプレートプライマーとして、50 μlの反応系で、37 ℃、10分間で、1 nmolのdTTPが酸性不溶物質に取り込むことができる酵素量とする。

 

ユニットアッセイ条件:

50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 6 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 0.01% IGEPAL CA-630, 0.5 mM dTTP, 0.4 mM poly(rA)•oligo(dT)18.

 

酵素濃度:

200,000 units/ml

 

酵素保存液組成:

・20 mM Tris-HCl
・100 mM NaCl
・1 mM Dithiothreitol
・0.1 mM EDTA
・50% Glycerol
・0.01% IGEPAL® CA-630
pH 7.5 @ 25°C

 

保存温度:

-20℃

メモ

一般的な反応条件:

・1X ProtoScript II Reverse Transcriptase Reaction Buffer
・10 mM DTT
・200 units  ProtoScript II Reverse Transcriptase
・0.5 mM dNTPs (別途用意:NEB#N0447)
・5 μM dT23VN (別途用意:NEB#S1327S)

42℃で30-60分間インキュベーション。

*ランダムプライマー(別途用意:NEB#S1330S)を用いる場合、42℃で反応させる前に、室温で10分間インキュベーションすることを推奨する。

ロット品質管理

それぞれのロットの品質管理の内容は製品添付のデータカードを参照。

 

品質管理:

ProtoScript II Reverse Transcriptaseの機能は、トータルRNAからRT-PCRで、 9.2 kb cDNAを合成することで確かめられている。

 

エキソヌクレアーゼのコンタミネーションチェック:

50 μlの反応溶液中、100 unitsのProtoScript II Reverse Transcriptaseおよび1 μgの1本鎖および2本鎖DNA([3H] E. coli DNA、105 cpm/μg)を加えたものを37℃において4時間インキュベーションする。この反応においてフリーの放射性ヌクレオチドの検出量が全体量の0.2%未満であることをエキソヌクレアーゼのコンタミネーションがないとの判断基準としている。

 

RNase のコンタミネーションチェック:

10 µlの反応液中、100 unitsのProtoScript II Reverse Transcriptaseおよび40 ng のRNA転写物を37℃において2時間インキュベートする。この反応によって、ゲル電気泳動でRNAの分解が検出されないことをRNaseのコンタミネーションがないとの判断基準としている。

 

タンパク質純度(SDS-PAGE):

SDS-PAGE後のクマシー染色によって、ProtoScript II Reverse Transcriptaseが 95%以上の純度であることを確認している。

参考文献

  1. Roth, M.J., Tanese, N. and Goff, S.P. (1985) J. Biol. Chem., 260, 9326-9335.
  2. Kotewicz, M.L. et al, (1988) Nuc. Acids Res., 16, 265-277.
  3. Lim, D. et al, (2006) J. Virol., 80, 8379-8389.
  4. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 5.52-5.55, 8.11-8.17.