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Gibson Assembly Cloning Kit

Gibson Assembly Cloning Kit カタログ番号:E5510

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E5510S 10 reactions ¥21,600 -80C

製品カテゴリ>グループ

  • DNA修飾酵素&クローニング>クローニングキット

特徴

DNA断片を1ステップ反応で簡単に繋ぎ合わすシステムです!
  ・ わずか15-60分間のインキュベーションで終了
  ・ PCRクローニングに最適
  ・ 複数DNA断片 (6本以上)の一括クローニング
  ・ 長鎖DNA (数百kb)の合成も可能
  ・ 面倒なディレクショナルクローニングも簡単
  ・ 高い形質転換のNEB 5-alpha コンピテントセルが付属
   

DNAとマスターミックスを混合するだけの1チューブ反応です!

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  実験手順
 

1.

 

15-20bpの相同配列を含むDNA断片、ベクター、マスターミックスを混合
  2. 50℃で15-60分間インキュベート
  3. 大腸菌に形質転換
     
   
   
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  プライマー設計ツールを利用可能
 

 

Gibson Assembly システム
 

Gibson Assembly はJ. Craig Venter InstituteのGibson博士らによって開発された方法であり、DNA断片のサイズや末端形状に関わらず、複数のDNA断片を繋ぎ合せることができる方法です。


末端に15塩基の相同配列があるDNA断片とGibson Assemblyマスターミックスを混合し、15-60分間インキュベーションするだけの1ステップ反応で複数のDNA断片を繋ぎ合せることができます。面倒な制限酵素やりガーゼによる処理は一切不必要な革新的なクローニング方法であり、PCRクローニング、複数DNA断片の一括クローニング、長鎖DNA(数百kb)の合成、ディレクショナルクローニングを簡単に行うことができます。

 
 図1:Gibson Assembly システムの原理
  Gibson Assembly システムは三つの異なる酵素反応を一つのバッファーで行うことで、複数のDNA断片を一括に繋ぎ合せることができるシステムです。(1)エキソヌクレアーゼが一本鎖の3'オーバーハングを作成し、他方の相補鎖(オーバーラップする部位)とアニーリングできるようにし、(2)ポリメラーゼでそれぞれのアニーリングした断片の間のギャップを埋め、(3)DNA ligaseでニックをつなぎ合わせてDNAをつなぎ合わせます。

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図2:高効率でクローニングが可能
 

Gibson Assembly システムは競合他社製品よりも高い効率でクローニングが可能である。1 kb、3 kb、5 kbのDNA断片のクローニング効率を比較したところ、Gibson Assembly システムは他社製品よりもクローニング効率が高いことが示されました。

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図3:長いDNAも高効率でクローニングが可能

 

Gibson Assembly システムは長いDNAも高効率でクローニングすることが可能です。1~12 kbの各DNA断片のクローニング効率を検証したところ、10 kb以上のDNAも高効率でクローニングできることが示されました。

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相同配列の設計方法

ギブソン・アッセンブリ―でDNA断片を繋ぎ合わすためには、15bp以上の相同配列が必要です。

他社同等品とは相同配列の設計が異なる場合がありますので、以下説明をご参照の上、相同配列を設計してください。

また相同配列の設計にはNEBuilder(オンライン・プライマー設計ツール)が便利ですので是非ともご利用ください。

 

  image オンライン・プライマー設計ツールを利用可能
 

 

図4:制限酵素で切断したベクターとPCRで増幅したインサートのつなぎ合わせ


制限酵素で切断した線状ベクターは、5'突出末端、3'突出末端、平滑末端のいずれかの末端形状になります。インサートDNAをPCRで増幅する場合、ベクターの末端形状によらず、ベクターの3'末端の最初の塩基から相同配列を設計します。例えば5'突出末端(図の1段目)の場合、陥没部分の3'末端に合わせて相同配列を設計します(Overlap Regions、最上段のオレンジ色の部分と最下段の青色の部分)。またインサートDNAのPCRには正確性と増幅性の高いQ5 DNA ポリメラーゼを推奨します。

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製品内容

キット内容:

・Gibson Assembly Master Mix (2X)
・Gibson Assembly Positive Control
・NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)
・SOC Outgrowth Medium
・pUC19 Transformation Control Plasmid

  

保存温度:
-20℃/-80℃

*製品は80℃で発送されますが、製品到着後はGibson Assembly Master Mixを-20℃で、コンピテントセルを80℃で保存してください。

メモ

1. 他社同等品とは相同配列の設計が異なる場合があるのでご注意ください。相同配列の設計にはNEBuilder(オンライン・プライマー設計ツール)が便利ですので是非ともご使用ください。

2. インサートDNAのPCRには正確性と増幅性が高いQ5 DNA ポリメラーゼを推奨します。

参考文献

  1. Gibson, D.G. et.al (2009) Nature Methods, 343-345.
  2. Gibson, D.G. et al. (2010) Nature Methods, 901-903.

関連製品

・Gibson Assembly Master Mix:ギブソン・アッセンブリ―試薬

・Q5 DNA ポリメラーゼ :インサートDNAのPCRにお薦めのDNA ポリメラーゼ