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IMPACT Kit

IMPACT Kitカタログ番号:E6901

カタログ番号

サイズ

濃度

価格(税別)

保存温度

E6901S 1 Set ¥77,800 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • タンパク質発現&精製>IMPACT発現システム

備考

  • 備考:価格改定 (2023年4月1日)

特徴

シングルカラムでタグ切断と精製ができるインテイン融合タンパク質発現システム

   
特長:  
・プロテアーゼ不要のシングルカラム精製 
・ベクター由来のアミノ酸を含まず、目的のタンパク質だけを精製可能 
・ タグの融合は目的タンパク質のN末端とC末端を選択可能 
・発現タンパク質のライゲーションやラベリングが可能 
・目的タンパク質のN末端Metを除去可能 
   
説明:  

IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)キットはインテインタグを利用したタンパク質発現キットであり、シングルカラムでタグ切断と目的タンパク質の精製ができる。タグの切断にはインテインの自己切断活性を利用するため、プロテアーゼは不要である。またベクター由来のアミノ酸を含まない目的タンパク質を精製できる。


IMPACT システムでは目的タンパク質にインテインタグとCBD(キチン結合ドメイン)が融合して発現される。発現はT7 プロモーターの発現制御下で行う。CBDが融合したタンパク質はキチンビーズに特異的に結合するため、簡単にアフィニティー精製ができる。さらにインテインはDTTなどのチオール存在下で自己切断を行うためオンカラム切断ができる。インテイン-CBDはキチンビーズに結合した状態であるため、目的タンパク質だけを溶出画分で精製できる。

   
IMPACT システム・ワークフロー(右図):
1) インテインの上流あるいは下流に目的遺伝子をクローニング
2)

大腸菌でインテイン-CBD融合目的タンパク質を発現

3)

キチンビーズ(カラム)に吸着

4)

DTTでインテインをオンカラム切断 

5)

溶出画分で目的タンパク質を精製

 

 

IMPACT システム発現例:
image

      Lane M:プロテインラダー

      Lane 1:大腸菌ライセート(非誘導)

      Lane 2:大腸菌ライセート(融合)

      Lane 3:オンカラム切断&精製画分

 Lane 4:精製MBPとペプチドのライゲーション産物

image

 

 

インテイン切断後の発現タンパク質はプロテイン(ペプチド)ライゲーションが可能:
image

 

pTXB1 ベクターで発現したIMPACT 発現タンパク質のC末端には活性チオエステルを生じるため、N末端にシステインを有するプロテインまたはペプチドとライゲーションができる。

 

原理:
1) pTXB1 ベクターでインテイン-CBD融合タンパク質を発現、キチンビーズに結合
2) DTTなどのチオール基を有する還元剤で切断
3)

切断された目的タンパク質のC末端に活性チオエステルが付加、別のペプチドのN末端システインのS原子が求核

4)

システイン中のN原子の求核反応によりS-N原子がシフト、ペプチドライゲーションが完了

 

キット内容

構成品の一部は個別販売もしています。

pTXB1 Vector

pTYB21 Vector

・pMXB10 Control Plasmid

Chitin Resin

・1 M DTT

Anti-CBD Monoclonal Antibody

Blue Loading Buffer Pack (SDS sample Buffer)

・E.coli B ER 2566(非コンピテントセル)*


*T7 Express Competent E.coli は別途販売