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NEB PCR Cloning Kit

NEB PCR Cloning Kitカタログ番号:E1202

カタログ番号

サイズ

濃度

価格(税別)

保存温度

E1202S 20 reactions ¥48,000 -80C

製品カテゴリ>グループ

  • DNA修飾酵素&クローニング>クローニングキット

備考

  • 備考:価格改定 (2023年4月1日)

特徴

バックグラウンドがゼロの簡単PCRクローニングキット

 

・平滑末端およびA突出末端のPCR産物のクローニングが可能

・DNAとマスターミックスを混合するだけの簡単プロトコール

・PCR産物の精製、リン酸化処理は不要

・低バックグラウンドでポジティブ・クローンを簡単に選別可能

・直鎖状ベクター、コンピテントセル付属、検証用プライマー付属

 

説明:

NEB PCRクローニングキットはPCR産物と付属のマスターミックスと直鎖状ベクターを混合し、付属コンピテントセルに形質転換するだけの簡単プロトコールのキットです。PCR産物の精製、リン酸化処理は一切不要、平滑末端、A突出末端断片のクローニングに対応しているため、Q5、 Phusion DNAポリメラーゼなどの高正確性のPCR酵素産物、Taq、OneTaq DNAポリメラーゼなどのルーチンPCR酵素産物のクローニングが可能です。

 

また、直鎖ベクターのセルフライゲーション産物が形質転換された大腸菌は死滅する独自の方法により、バックグラウンドがありません。プレート上にコロニーを形成した大腸菌はインサートを含んだベクターを保有するポジティブ・クローン(大腸菌)になるので、わずらわしいバックグラウンドのクローンに悩まされることはありません。

 

 

 

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図1:バックグラウンドがゼロのPCRクローニングが可能

500bpのPCR産物をベクターにクローニングして形質転換し培養したプレート(右)には多数のコロニーが形成されていることに対して、ベクターのみを形質転換して培養したプレート(左)にはコロニーが形成されないことから、バックグラウンドがほぼゼロであることが示唆される。(メカニズムは図3参照)

 

 

 

 

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図2:PCRクローニングキットの実験手順

5分で終了のライゲーション反応、大腸菌への形質転換の簡単プロトコール

 

 

 

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図3:pMiniTベクター
インサート挿入部位周辺には制限酵素サイトが位置し、サブクローニングに便利である。また、付属プライマーを使用すればPCRによりインサートの確認・増幅が可能である。

毒性ミニ遺伝子:
キットには毒性ミニ遺伝子のORFが分断された直鎖状pMiniTベクターが付属している。インサートが挿入されると、毒性ミニ遺伝子が発現しないので、形質転換された大腸菌は成育するこことができ、プレートにコロニーを形成する(インサートを含むポジティブ・クローン)。セルフライゲーションされた環状pMiniTベクターが形質転換された大腸菌中では毒性ミニ遺伝子が発現して大腸菌が死滅するのでプレートにコロニーを形成することができない。(図1参照)

 

酵素特性および使用方法

保存温度:

-80℃

*製品到着後または初回使用後は、コンピテントセルを-80℃で保存、Cloning Master Mixおよびベクター・プライマーを-20℃で保存、SOC培地は4℃もしくは常温で保存してください。

キット内容

キット内容:

・Cloning Mix 1

・Cloning Mix 2

・Linearized pMiniT 2.0 Vector

・Cloning Analysis Forward Primer 

・Cloning Analysis Reverse Primer

・NEB 10-beta Competent E. coli (Cloning Efficiency) 

・pUC19 Transformation Control Plasmid

・SOC Outgrowth Medium

・Amplicon Cloning Control

 

保存温度:

-80℃

*製品到着後または初回使用後は、コンピテントセルを-80℃で保存、Cloning Master Mixおよびベクター・プライマーを-20℃で保存、SOC培地は4℃もしくは常温で保存してください。