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NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kitカタログ番号:E5520

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E5520S 10 reactions ¥22,000 -80C

製品カテゴリ>グループ

  • DNA修飾酵素&クローニング>クローニングキット

特徴

シームレスに DNA 断片を 1 ステップで繋ぎ合わすアッセンブリーシステム
 

NEBuilder HiFi DNA アッセンブリーは DNA 断片を 1 ステップ反応で簡単に繋ぎ合わすことができるシステムである。末端に 15 塩基の相同配列がある DNA 断片(主に PCR で調製)とマスターミックスを混合し、15 - 60 分間インキュベーションするだけの 1 ステップ反応で、PCR 産物とベクターをアッセンブルできる。さらにそのまま精製なく形質転換できるので、従来のクローニングよりも短時間かく高効率でクローニング・ポジティブクローンを取得できる。また複数の DNA 断片をアッセンブルしたり、1本鎖 DNA (主にオリゴ合成)もアッセンブルできる。


また従来の Gibson Assembly と比較してアッセンブル効率と正確性が向上していることに加え(詳細説明)、制限酵素で切断したベクターの内側にもアッセンブルできるため、シームレスなクローニングが可能である。

 
特長:
・わずか15-60分間でアッセンブル完了
・末端形状を問わずアッセンブル(平滑、5'突出、3'突出)
・制限サイトに影響されず、好きな位置にシームレスにアッセンブル
・1~6 断片の PCR 産物とベクターを高効率かつ正確にアッセンブル
・1本鎖オリゴDNAとベクターをアッセンブル(sgRNA発現ベクターの作成など)
・部位特異的変異導入など、本製品で様々なアプリケーションに対応可能
・ライセンスフリー

・コンピテントセル付属(NEB 5-alpha Competent E.coli、< 10 kb アッセンブリ)

・プライマー設計ツール公開(Nebuilder.neb.com
 

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図 1 : NEBuilder アッセンブリーの原理

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 1) 末端に 15~30 bp の相同配列を持つ DNA 断片を使用する(図中、A と B)

 2) 5' エキソヌクレアーゼが DNA 末端から 5' → 3' 方向に分解する
 3) 40 ~ 80 bases の 3' 突出末端が産生される
 4) 突出末端中の相同配列がアニーリングする(図中、茶色と水色)
 5) DNA ポリメラーゼがギャップを埋める
 6) Taq DNA リガーゼがニックを埋める(この際、DNA 分子はライゲーションされない)
 7) ギャップやニックがない、完全な 2 本鎖 DNA が産生される
 動画:NEBuilder の原理と特長

  
図 2 : NEBuilder アッセンブリーによる PCR クローニングのワークフロー

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動画:NEBuilder / Golden Gate のプライマーデザイン方法

  
図 3 : Gibson アッセンブリーよりも高効率で、複数断片もアッセンブル
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NEBuilder は Gibson よりも高効率かつ正確に 1~6 本の PCR 産物をベクターにアッセンブルできる。



  
図 4 : 微量 DNA も高効率でアッセンブル
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通常は数十 ng の DNA を使用するが、fg オーダーの DNA もアッセンブルできる。この場合、相同配列を長く設定する。



  
図 5 : 他社製品よりも高効率でアッセンブル
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1本のDNA断片(PCR 産物)とベクター(制限酵素で断片化)をアッセンブルした結果、NEBuilder でより多くのコロニーが得られた。各社試薬の推奨設定で相同配列を設定し、推奨反応条件下でアッセンブルした。アッセンブル産物の 2 ul を各社推奨のコンピテントセルに形質転換して、outgrowth 後の 1/50 量をアンピシリン選択培地にプレーティングした。



  
図 6 : ベクター切断面に影響されず、シームレスにアッセンブル
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NEBuilder/Gibson アッセンブリでは、基本的にベクターの切断面の 3' 末端に合わせて相同配列付きプライマーを設計する(図中、a、b、c、および Gene-specific Forward/Reverse PCR Primer)。しかしながら NEBuilder ではベクター切断面の内側(10 nt 以内)であれば、自由にプライマーを設計してよりシームレスなクローニングができる(図中、赤線内)。これは NEBuilder マスターミックスに含まれる DNA ポリメラーゼの校正機能と 5'→3' エキソヌクレアーゼにより可能となっており、従来の Gibson や他社製品ではできないアッセンブルである。

動画:NEBuilder の 3' ミスマッチ除去


  
図 7 : 1 本鎖オリゴ DNA もアッセンブル可能
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NEBuilder は 1 本鎖オリゴ DNA もアッセンブルできる。制限酵素で切断したベクター(20 ng、CRISPR Nuclease OFP Reporter)と合成した 1 本鎖オリゴ DNA を各社キットで50 ℃、15 分間のアッセンブルし、NEB 10-beta competent E.coli に形質転換したところ、NEBuilder で多くのコロニーが得られた。このうち、約 90 %がポジティブクローンであった。


動画:NEBuilder の ssDNA アッセンブリ

  
図 8 : 部位特異的変異導入など、本製品で様々なアプリケーションに対応可能

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2-fragment assembly :
  最もシンプルかつ一般的なアッセンブル。PCR 産物とベクターをアッセンブルする。インサート長は相同配列を含めて 200 bp 以上が必要である。
   
4-fragment assembly :
  ここでは 3 つの DNA 断片とベクターのアッセンブルを示しているが、様々な数の複数断片の一括アッセンブルが可能である。この際、相同配列を長く設計することにより、高効率のアッセンブルが可能となる。
   
3'- and 5'-end mismatch assembly :
  ベクター切断面の内側にアッセンブルする。ベクター末端がミスマッチとして認識、除去されるため、ミスマッチアッセンブルと呼ばれる。
   
ssOligo & dsDNA assembly :
  1 本鎖オリゴ DNA とベクターのアッセンブル。sgRNA 発現ベクターなどの作成に使用される。通常のアッセンブルよりも長い相同配列が必要である(25 - 30 nt)。
   
Annealed-oligo assembly :
  1 本鎖オリゴ DNA をオーバーラップするようにアッセンブルすることも可能である。
   
Site-directed mutagenesis :
  相同配列中に塩基置換を入れることにより、部位特異的変異導入が可能である。

  
Gibson Assembly との違い:

 ・酵素と反応バッファーの改良により、アッセンブル効率と正確性が向上

 ・5'と3'ミスマッチを除去できるため、より自由度が高いアッセンブルが可能(図6参照)
 ・ssDNA のアッセンブルが可能
 ・同じプライマーを使用できるため、切り替えが容易
 ・NEBuilder はライセンスフリー

日本語マニュアル

日本語マニュアル 

* 本マニュアルはオリジナル英語マニュアル version 3.0 に基づいて作成されています。

製品のご使用にあたり、必ず最新の英語マニュアルをご確認ください。

キット内容

キット内容:

・NEBuilder High-Fidelity Master Mix 

・NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)

・SOC Outgrowth Medium

・NEBuilder Positive Control

・pUC19 Transformation Control Plasmid


保存温度:

-80℃*

*製品は-80℃で発送されますが、製品到着後は NEBuilder High-Fidelity Master Mix を-20℃で、コンピテントセルを-80℃で保存してください。

メモ

1. 他社同等品とは相同配列の設計が異なる場合がある。相同配列の設計には NEBuilder(オンライン・プライマー設計ツール)の使用を推奨する。


2. インサート DNA の PCR には正確性と増幅性が高い Q5 DNA ポリメラーゼを推奨する。


3. アッセンブル産物を大腸菌に形質転換する場合、NEB のコンピテントセルを推奨する。または NEBuilder アッセンブリ―試薬とコンピテントセルとのセット(NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit)も便利である。


4. 自作もしくは他社コンピテントセルも使用できるが、コロニー数が少なくなることがある。ポジティブコントロールで 50 - 100 個のコロニーが得られるよう、形質転換に使用するアッセンブル産物の量(通常 2 ul のところ、1 ul)と希釈率(通常原液のところ、1/2、1/4、1/8 希釈)を最適化するとよい。

関連製品

NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle for Large Fragments:NEB 10-beta コンピテントセルが付属、> 10 kb のアッセンブルにお薦め

NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix:アッセンブリー試薬

Q5 High-Fidelity DNA Polymerase:インサートの PCR 調製に最適な高正確性 DNA ポリメラーゼ

クローニング用コンピテントセル