NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (E5520)

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NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit

NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kitカタログ番号:E5520

カタログ番号	サイズ	濃度	価格	保存温度
E5520S	10 reactions		¥25,400	-80C

製品カテゴリ>グループ

ＤＮＡ修飾酵素&クローニング>クローニングキット

備考

備考：価格改定 (2022年10月1日)

特徴

シームレスに DNA 断片を 1 ステップで繋ぎ合わすアッセンブリーシステム

NEBuilder HiFi DNA アッセンブリーは DNA 断片を 1 ステップ反応で簡単に繋ぎ合わすことができるシステムである。末端に 15 塩基の相同配列がある DNA 断片（主に PCR で調製）とマスターミックスを混合し、15 - 60 分間インキュベーションするだけの 1 ステップ反応で、PCR 産物とベクターをアッセンブルできる。さらにそのまま精製なく形質転換できるので、従来のクローニングよりも短時間かく高効率でクローニング・ポジティブクローンを取得できる。また複数の DNA 断片をアッセンブルしたり、1本鎖 DNA （主にオリゴ合成）もアッセンブルできる。

また従来の Gibson Assembly と比較してアッセンブル効率と正確性が向上していることに加え（詳細説明）、制限酵素で切断したベクターの内側にもアッセンブルできるため、シームレスなクローニングが可能である。

特長：

・わずか15-60分間でアッセンブル完了

・末端形状を問わずアッセンブル（平滑、5'突出、3'突出）

・制限サイトに影響されず、好きな位置にシームレスにアッセンブル

・1～6 断片の PCR 産物とベクターを高効率かつ正確にアッセンブル

・1本鎖オリゴDNAとベクターをアッセンブル（sgRNA発現ベクターの作成など）

・部位特異的変異導入など、本製品で様々なアプリケーションに対応可能

・ライセンスフリー

・コンピテントセル付属（NEB 5-alpha Competent E.coli、< 10 kb アッセンブリ）

・プライマー設計ツール公開（Nebuilder.neb.com）

図 1 : NEBuilder アッセンブリーの原理

1) 末端に 15～30 bp の相同配列を持つ DNA 断片を使用する（図中、A と B）

2) 5' エキソヌクレアーゼが DNA 末端から 5' → 3' 方向に分解する

3) 40 ～ 80 bases の 3' 突出末端が産生される

4) 突出末端中の相同配列がアニーリングする（図中、茶色と水色）

5) DNA ポリメラーゼがギャップを埋める

6) Taq DNA リガーゼがニックを埋める（この際、DNA 分子はライゲーションされない）

7) ギャップやニックがない、完全な 2 本鎖 DNA が産生される

動画：NEBuilder の原理と特長

図 2 : NEBuilder アッセンブリーによる PCR クローニングのワークフロー

動画：NEBuilder / Golden Gate のプライマーデザイン方法

図 3 : Gibson アッセンブリーよりも高効率で、複数断片もアッセンブル

NEBuilder は Gibson よりも高効率かつ正確に 1～6 本の PCR 産物をベクターにアッセンブルできる。

図 4 : 微量 DNA も高効率でアッセンブル

通常は数十 ng の DNA を使用するが、fg オーダーの DNA もアッセンブルできる。この場合、相同配列を長く設定する。

図 5 : 他社製品よりも高効率でアッセンブル

1本のDNA断片（PCR 産物）とベクター（制限酵素で断片化）をアッセンブルした結果、NEBuilder でより多くのコロニーが得られた。各社試薬の推奨設定で相同配列を設定し、推奨反応条件下でアッセンブルした。アッセンブル産物の 2 ul を各社推奨のコンピテントセルに形質転換して、outgrowth 後の 1/50 量をアンピシリン選択培地にプレーティングした。

図 6 : ベクター切断面に影響されず、シームレスにアッセンブル

NEBuilder/Gibson アッセンブリでは、基本的にベクターの切断面の 3' 末端に合わせて相同配列付きプライマーを設計する（図中、a、b、c、および Gene-specific Forward/Reverse PCR Primer)。しかしながら NEBuilder ではベクター切断面の内側（10 nt 以内）であれば、自由にプライマーを設計してよりシームレスなクローニングができる（図中、赤線内）。これは NEBuilder マスターミックスに含まれる DNA ポリメラーゼの校正機能と 5'→3' エキソヌクレアーゼにより可能となっており、従来の Gibson や他社製品ではできないアッセンブルである。

動画：NEBuilder の 3' ミスマッチ除去

図 7 : 1 本鎖オリゴ DNA もアッセンブル可能

NEBuilder は 1 本鎖オリゴ DNA もアッセンブルできる。制限酵素で切断したベクター（20 ng、CRISPR Nuclease OFP Reporter）と合成した 1 本鎖オリゴ DNA を各社キットで50 ℃、15 分間のアッセンブルし、NEB 10-beta competent E.coli に形質転換したところ、NEBuilder で多くのコロニーが得られた。このうち、約 90 %がポジティブクローンであった。

動画：NEBuilder の ssDNA アッセンブリ

図 8 : 部位特異的変異導入など、本製品で様々なアプリケーションに対応可能

2-fragment assembly :
	最もシンプルかつ一般的なアッセンブル。PCR 産物とベクターをアッセンブルする。インサート長は相同配列を含めて 200 bp 以上が必要である。

4-fragment assembly :
	ここでは 3 つの DNA 断片とベクターのアッセンブルを示しているが、様々な数の複数断片の一括アッセンブルが可能である。この際、相同配列を長く設計することにより、高効率のアッセンブルが可能となる。

3'- and 5'-end mismatch assembly :
	ベクター切断面の内側にアッセンブルする。ベクター末端がミスマッチとして認識、除去されるため、ミスマッチアッセンブルと呼ばれる。

ssOligo & dsDNA assembly :
	1 本鎖オリゴ DNA とベクターのアッセンブル。sgRNA 発現ベクターなどの作成に使用される。通常のアッセンブルよりも長い相同配列が必要である（25 - 30 nt）。

Annealed-oligo assembly :
	1 本鎖オリゴ DNA をオーバーラップするようにアッセンブルすることも可能である。

Site-directed mutagenesis :
	相同配列中に塩基置換を入れることにより、部位特異的変異導入が可能である。

Gibson Assembly との違い：

・酵素と反応バッファーの改良により、アッセンブル効率と正確性が向上

・5'と3'ミスマッチを除去できるため、より自由度が高いアッセンブルが可能（図6参照）

・ssDNA のアッセンブルが可能

・同じプライマーを使用できるため、切り替えが容易

・NEBuilder はライセンスフリー

プロトコール

プロトコール＆マニュアル（英語）

日本語マニュアル

・日本語マニュアル

* 本マニュアルはオリジナル英語マニュアル version 3.0 に基づいて作成されています。

製品のご使用にあたり、必ず最新の英語マニュアルをご確認ください。

キット内容

キット内容：

・NEBuilder High-Fidelity Master Mix

・NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency)

・SOC Outgrowth Medium

・NEBuilder Positive Control

・pUC19 Transformation Control Plasmid

保存温度：

-80℃*

*製品は－80℃で発送されますが、製品到着後は NEBuilder High-Fidelity Master Mix を－20℃で、コンピテントセルを－80℃で保存してください。

技術資料

・冊子：クローニング（DNA アッセンブリ & 合成生物学）

・Construction of an sgRNA-Cas9 expression vector

・Improved method for assembly of linear yeast expression

・Improved methods for site directed mutagenesis using NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix

NEB TV Japan : 日本語字幕付き動画

NEBuilder の原理と特長		NEBuilder/Golden Gate のプライマーデザイン方法


NEBuilder の 3' ミスマッチ除去		NEBuilder の ssDNA アッセンブリ
		View alll original videos (English)

メモ

1. 他社同等品とは相同配列の設計が異なる場合がある。相同配列の設計には NEBuilder（オンライン・プライマー設計ツール）の使用を推奨する。

2. インサート DNA の PCR には正確性と増幅性が高い Q5 DNA ポリメラーゼを推奨する。

3. アッセンブル産物を大腸菌に形質転換する場合、NEB のコンピテントセルを推奨する。または NEBuilder アッセンブリ―試薬とコンピテントセルとのセット（NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit）も便利である。

4. 自作もしくは他社コンピテントセルも使用できるが、コロニー数が少なくなることがある。ポジティブコントロールで 50 - 100 個のコロニーが得られるよう、形質転換に使用するアッセンブル産物の量（通常 2 ul のところ、1 ul）と希釈率（通常原液のところ、1/2、1/4、1/8 希釈）を最適化するとよい。