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NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illuminaカタログ番号:E7645

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E7645S 24 reactions ¥97,300 -20C
E7645L 96 reactions ¥311,500 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用(DNA, ChIP, mRNA, Small RNA)

特徴

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit はイルミナ用 DNA ライブラリー調製試薬である。わずか 500 pg の DNA から 3 時間以内で調製ができる。インプット DNA として、あらかじめ断片化されたゲノムDNAや、断片化の必要がないDNA(ChIP-DNAやFFPE DNA、PCR アンプリコンなど)からライブラリーを調製する。

 

DNA の断片化が必要な場合、コバリスなどの機器や酵素などであらかじめ断片化しておく。あるいは酵素的断片化が組み込まれた NEBNext Ultra II FS DNA Kit (NEB #E7805)を使用する。

 
特長:
・ 500 pg DNA より高収量でライブラリー調製
・ 500 pg - 1 µg の広域インプット量 から調製
・ 断片化済みゲノム DNA の他、ChIP / FFPE DNA / PCR アンプリコンなど、様々なインプットに対応

・ GC 含量によらず、ゲノム全体を均一にカバーしたライブラリー調製

・ エンリッチメントシステムとの併用が可能
・ 短時間かつ最小限のハンズオンで調製、自動化にも対応
・ 各ステップの試薬はモジュールとして購入可能
・ 6,000 報以上の論文実績 (NEBNext 全体)、サンガー研究所など世界各地の大型センターで導入
・ DNA 精製ビーズ付きキットも別途販売中(NEB #E7103
 

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インプットサンプル : 断片化された 2 本鎖 DNA
・切断済みゲノム DNA
・ChIP DNA
・PCR アンプリコン (それ以上の断片化が必要ない場合)
・分解が進んだ FFPE DNA
 など
 
イルミナ社対応シーケンサー:

・非整列化フローセルタイプ : MiSeq、MiniSeq、NextSeq 550、HiSeq 2500

・整列化フローセルタイプ : iSeq 100、NextSeq 2000、HiSeq 3000/4000、HiSeq X、NovaSeq 6000

 

 

 Ultra II DNA ライブラリー調製のワークフロー:

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Figure 1. 広域インプット量からライブラリーを調製

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A) 各社キットおよび推奨プロトコールを用いて、ヒト NA19240 ゲノム DNA からライブラリーを調製した。インプット量および PCR サイクル数を図中に示す。サイズセレクションは未実施で評価した。

 

B) ヒト NA19240 ゲノム DNA からアダプターライゲーションまで実施、qPCR で産物を定量、インプット DNA からアダプターライゲーション産物への変換率を算出した。NEBNext ではほぼすべてのインプットにアダプターが付加していることが示された。

 

 

Figure 2. 高/低 GC ゲノムでも均一なカバレッジでライブラリー調製

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GC 含量が異なる 3 種類のバクテリアゲノムからライブラリーを調製、MiSeq でシーケンスした結果、どのバクテリアもゲノム全体を均一にカバーしていることが示された(図中、紫、赤、ピンク)。またインプット DNA 量を変えても均一性は保たれていた。Bowtie 2.2.4 でマッピング、Picard's CollectGCBiasMetrics (v1.117) で GC カバレッジを算出した。理論値を Y 軸 1.0 の線で示す。また各 GC 含量における 100 bp 領域数を灰色の縦グラフで示す。

 

 

Table 1. FFPE DNA からもライブラリー調製可能
 
FFPE DNA

 DNA INPUT (ng)

LIBRARY YIELDS (ng) % MAPPED % MAPPED IN PAIRS % DUPLICATION % CHIMERAS
Kidney Tumor 17 132 91.5 96.1 0.48 3
Lung Tumor 20 232 90.1 94.9 0.42 4.1
Liver Normal 20 691 92.6 94.7 0.33 8.6
Breast Tumor 30 514 91.9 95.1 0.37 4.5
 

表中のヒト FFPE 検体か抽出した 17-30 ng の DNA を使用してライブラリー調製を実施 (PCR は 10 サイクル)、Illumina MiSeq でシーケンスした。得られたリードを GRCh37 リファレンスゲノム にマッピングした (Bowtie 2.2.4.)。


% Mapped: トータルリードに対する、ヒト GRCh37 リファレンスゲノムにマッピングされたリード割合 

% Mapped in Pairs: メイトペアがリファレンスにアライメントされた割合

% Duplication: 重複として検出されたマッピングリード率

% Chimeras: 最大インサート長外にマッピングされたリードおよび末端配列が異なる染色体にマッピングされたリードの割合


マッピング率が高いこと、重複およびキメラ率が低いことから、NEBNext Ultra II DNA Kit は FFPE DNA であってもライブラリー調製ができることが示された。なお、FFPE サンプルによってはダメージや変異が多い場合があるため、それが予想される場合やライブラリー調製効率が低い場合には、修復キット (NEB #M6630) を使用するとよい。

 

 

Figure 3. PCR フリー・ワークフローにも対応*

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100 ng のヒト NA 19240 ゲノム DNA から、各社キットと推奨プロトコールを用いて PCR フリー・ライブラリー調製を実施、qPCR でライブラリーを定量した結果、NEBNext Ultra II DNA Kit は高収量でライブラリー調製ができることが示された。

 

*PCR フリー・ワークフローには、別途アダプターを自作または他社より購入する。

 
Library Kit Total Reads % Duplication % Mapped % Chimeras
Ultra II 3,685,029 0.02 97 1.1
Kapa Hyper 3,679,136 0.02 97 2
TruSeq PCR-Free 3,681,643 0.05 96.65 1.38

 

さらに Illumina NextSeq 500 でシーケンス、得られたリードを GRCh37 リファレンスにマッピングした (Bowtie 2.2.4.)。

 

% Mapped: トータルリードに対する、ヒト GRCh37 リファレンスゲノムにマッピングされたリード割合 

% Duplication: 重複として検出されたマッピングリード率
% Chimeras: 
最大インサート長外にマッピングされたリードおよび末端配列が異なる染色体にマッピングされたリードの割合

 

 

Figure 4. エンリッチシステムと併用可能
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Nimblegen® と SureSelectXT エンリッチメントシステムと、NEBNext を含む 3 種類のライブラリー調製キットを併用してライブラリーを調製、収量を比較した結果、Pre- / post- エンリッチメントのいずれの場合でも、NEBNext が少ない PCR サイクル数で高い収量が得られることが示された。


Nimblegen® エンリッチメントの場合、NimbleGen SeqCap Human Exome v3 を用いて、100 ng のヒト HG02922 ゲノム DNA から  濃縮とライブラリー調製をおこなった。ライブラリー調製キットとオリゴキットの組み合わせは以下のとおりである。

 ・NEBNext Ultra II Library prep kit + NEBNext Multiplex Oligos for Illumina

 ・Kapa Library Preparation Kit + SeqCap® Adapter Kit (Roche)


SureSelectXT エンリッチメントの場合、ureSelect® Human All Exon V6 を用いて、200 ng のヒト HG02922 ゲノム DNA から  濃縮とライブラリー調製をおこなった。ライブラリー調製キットとオリゴキットの組み合わせは以下のとおりである。

 

 ・NEBNext Ultra II Library prep kit + NEBNext Multiplex Oligos for Illumina

 ・Kapa Hype Library Preparation Kit + NEBNext Multiplex Oligos for Illumina

 ・SureSelectXT Reagent Kit (Herculase® II Fusion DNA Polymerase)

日本語マニュアル

日本語マニュアル

* 本マニュアルはオリジナル英語マニュアル version 6.1 に基づいて作成されています。

   製品のご使用にあたり、必ず最新の英語マニュアルをご確認ください。

別途必要な試薬等

アダプターオリゴ

・DNA 精製ビーズ (SPRIselect® beads、AMPure® XP Beads (Beckman Coulter, Inc.) を推奨) など

キット内容

・NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix *1

・NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer *1

・NEBNext Ultra II Ligation Master Mix *2

・NEBNext Ligation Enhancer *2

・NEBNext Ultra II Q5 Master Mix *3


*アダプターオリゴは別売

*1 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (#E7546)  として別途購入可能

*2 NEBNext Ultra II Ligation Module (#E7595) として別途購入可能

*3 NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (#M0544) として別途購入可能