NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit はイルミナ用 DNA ライブラリー調製試薬である。わずか 500 pg の DNA から 3 時間以内で調製ができる。インプット DNA として、あらかじめ断片化されたゲノムDNAや、断片化の必要がないDNA（ChIP-DNAやFFPE DNA、PCR アンプリコンなど）からライブラリーを調製する。

DNA の断片化が必要な場合、コバリスなどの機器や酵素などであらかじめ断片化しておく。あるいは酵素的断片化が組み込まれた NEBNext Ultra II FS DNA Kit (NEB #E7805)を使用する。

・ GC 含量によらず、ゲノム全体を均一にカバーしたライブラリー調製

・非整列化フローセルタイプ ： MiSeq、MiniSeq、NextSeq 550、HiSeq 2500

・整列化フローセルタイプ ： iSeq 100、NextSeq 2000、HiSeq 3000/4000、HiSeq X、NovaSeq 6000

A) 各社キットおよび推奨プロトコールを用いて、ヒト NA19240 ゲノム DNA からライブラリーを調製した。インプット量および PCR サイクル数を図中に示す。サイズセレクションは未実施で評価した。

B) ヒト NA19240 ゲノム DNA からアダプターライゲーションまで実施、qPCR で産物を定量、インプット DNA からアダプターライゲーション産物への変換率を算出した。NEBNext ではほぼすべてのインプットにアダプターが付加していることが示された。

GC 含量が異なる 3 種類のバクテリアゲノムからライブラリーを調製、MiSeq でシーケンスした結果、どのバクテリアもゲノム全体を均一にカバーしていることが示された（図中、紫、赤、ピンク）。またインプット DNA 量を変えても均一性は保たれていた。Bowtie 2.2.4 でマッピング、Picard's CollectGCBiasMetrics (v1.117) で GC カバレッジを算出した。理論値を Y 軸 1.0 の線で示す。また各 GC 含量における 100 bp 領域数を灰色の縦グラフで示す。

表中のヒト FFPE 検体か抽出した 17-30 ng の DNA を使用してライブラリー調製を実施 (PCR は 10 サイクル)、Illumina MiSeq でシーケンスした。得られたリードを GRCh37 リファレンスゲノム にマッピングした (Bowtie 2.2.4.)。

% Mapped: トータルリードに対する、ヒト GRCh37 リファレンスゲノムにマッピングされたリード割合 

% Mapped in Pairs: メイトペアがリファレンスにアライメントされた割合

% Duplication: 重複として検出されたマッピングリード率

% Chimeras: 最大インサート長外にマッピングされたリードおよび末端配列が異なる染色体にマッピングされたリードの割合

マッピング率が高いこと、重複およびキメラ率が低いことから、NEBNext Ultra II DNA Kit は FFPE DNA であってもライブラリー調製ができることが示された。なお、FFPE サンプルによってはダメージや変異が多い場合があるため、それが予想される場合やライブラリー調製効率が低い場合には、修復キット (NEB #M6630) を使用するとよい。

Figure 3. PCR フリー・ワークフローにも対応*

100 ng のヒト NA 19240 ゲノム DNA から、各社キットと推奨プロトコールを用いて PCR フリー・ライブラリー調製を実施、qPCR でライブラリーを定量した結果、NEBNext Ultra II DNA Kit は高収量でライブラリー調製ができることが示された。

*PCR フリー・ワークフローには、別途アダプターを自作または他社より購入する。

さらに Illumina NextSeq 500 でシーケンス、得られたリードを GRCh37 リファレンスにマッピングした (Bowtie 2.2.4.)。

% Mapped: トータルリードに対する、ヒト GRCh37 リファレンスゲノムにマッピングされたリード割合 

% Duplication: 重複として検出されたマッピングリード率
% Chimeras: 最大インサート長外にマッピングされたリードおよび末端配列が異なる染色体にマッピングされたリードの割合

Nimblegen® と SureSelectXT エンリッチメントシステムと、NEBNext を含む 3 種類のライブラリー調製キットを併用してライブラリーを調製、収量を比較した結果、Pre- / post- エンリッチメントのいずれの場合でも、NEBNext が少ない PCR サイクル数で高い収量が得られることが示された。

Nimblegen® エンリッチメントの場合、NimbleGen SeqCap Human Exome v3 を用いて、100 ng のヒト HG02922 ゲノム DNA から  濃縮とライブラリー調製をおこなった。ライブラリー調製キットとオリゴキットの組み合わせは以下のとおりである。

 ・NEBNext Ultra II Library prep kit + NEBNext Multiplex Oligos for Illumina

 ・Kapa Library Preparation Kit + SeqCap® Adapter Kit (Roche)

SureSelectXT エンリッチメントの場合、ureSelect® Human All Exon V6 を用いて、200 ng のヒト HG02922 ゲノム DNA から  濃縮とライブラリー調製をおこなった。ライブラリー調製キットとオリゴキットの組み合わせは以下のとおりである。

 ・NEBNext Ultra II Library prep kit + NEBNext Multiplex Oligos for Illumina

 ・Kapa Hype Library Preparation Kit + NEBNext Multiplex Oligos for Illumina

 ・SureSelectXT Reagent Kit (Herculase® II Fusion DNA Polymerase)