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T4 Polynucleotide Kinase

T4 Polynucleotide Kinaseカタログ番号:M0201

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

M0201S 500 units 10,000 units/ml ¥8,100 -20C
M0201L 2,500 units 10,000 units/ml ¥32,200 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • DNA修飾酵素&クローニング>DNAキナーゼ&DNAホスファターゼ

特徴

特長:

・ ライゲーションのためのDNAおよびRNAの5' リン酸化

・ プローブ作製やDNA シーケンシングのためのDNAおよびRNAの末端ラベリング

・ 3' リン酸基の除去

・ RNaseおよびDNaseフリー

 

説明:

T4ポリヌクレオチドキナーゼは、ATPのγ位のPiをポリヌクレオチド(2本鎖および1本鎖DNA、RNA)ならびにヌクレオシド3'-一リン酸塩の5'-ヒドロキシル末端への移転あるいは交換を触媒する (1-5)。3'-リン酸ポリヌクレオチド、デオキシヌクレオシド 3'-一リン酸塩およびデオキシヌクレオシド3'-二リン酸塩からの3'-リン酸基の除去も触媒する。キナーゼ活性を有するが、3'ホスファターゼの活性は保有しない改良型酵素も別途販売している(#M0236)。

 

T4 PNKはDNAの5'末端を効率的にリン酸化:

M0201

 

由来:

T4 Polynucleotide Kinase 遺伝子を有する大腸菌

 

付属試薬:

T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X)

酵素特性および使用方法

ユニット定義:

1 Richardson unitは、37 ℃、30分間で、1 nmolの酸不溶性 [32P] の取り込みを触媒する酵素量として定義される。1X T4 Polynucleotide Kinase反応バッファー中、、66 μM [γ-32P] ATP (5 x 106 cpm/μmol)および 0.26 mM 5'-ヒドロキシル-末端を有するサケ精子DNAを含む反応溶液中でアッセイ。

 

反応条件:

1X T4 Polynucleotide Kinase Buffer

37℃でインキュベート

 

1X T4 Polynucleotide Kinase Buffer 組成:

・70 mM Tris-HCl

・10 mM MgCl2

・5 mM DTT

pH 7.6 @ 25°C

 

酵素濃度:

10,000 units/ml

 

酵素保存溶液の組成:

・10 mM Tris-HCl

・50 mM KCl

・1 mM DTT

・0.1 mM EDTA

・50% Glycerol

・0.1 μM ATP

pH 7.4 @ 25°C

 

熱による不活性化:

65℃、20分間

 

保存条件:

-20℃

メモ

  1. 最適な反応のためには新鮮なバッファーを使用する必要がある (古いバッファー中のDTTは酸化により劣化しているため、活性を低下させる)。
  2. 放射性標識化には、1X T4 Polynucleotide Kinase 反応バッファーを含む50 μl反応溶液に1-50 pmolの5'末端、50 pmolのγ-[32]P ATPおよび20ユニットのT4 ポリヌクレオチドキナーゼを加え、37 ℃で30分間インキュベートする。[32P] ATPの代わりに[33P] ATPを使用してもよい。
  3. ATPの代わりに、CTP、GTP、TTP、UTP、dATPもしくはdTTPもリン酸供与体に使用できる。
  4. 放射能標識化を伴わないリン酸化には、1 X T 4 Polynucleotide Kinase 反応バッファーを含む50 μl反応液に300 pmolまでの5'末端、1 mM ATPおよび10ユニットのT4 ポリヌクレオチドキナーゼを加え、37 ℃で30分間インキュベートする。また1X T4 DNA Ligase反応バッファーは1 mM ATPを含むため、代用品として使用することができる(T4 ポリヌクレオチドキナーゼはこのバッファーにおいて100%の活性を示す)。
  5. 平滑および陥没した5 ' 末端のリン酸化効率を向上させるためには、70℃で5分間加熱後、氷上で冷やしてからキナーゼを添加し、PEG-8,000を5%(w/v)まで加える。
  6. 上記の反応バッファーに下記を添加した場合、以下のようなT4 ポリヌクレオチドキナーゼの阻害がみられる:
    50 mM NaCl -阻害無し
    100 mM NaCl - 30%阻害
    150 mM NaCl - 50%阻害
    7 mMリン酸 - 50%阻害
    7 mM (NH4)2SO4 - 75%阻害
  7. ポリヌクレオチドキナーゼはアンモニウムイオンによって阻害されるため、リン酸化の前にアンモニウムイオンの存在下でDNAを沈殿させるべきではない。
  8. 末端標識前の脱リン酸化は交換反応を利用することによって回避することができるが、標識化効率は低
    い。最終反応で付属のバッファーに100 μM ADPを添加することによって十分な取り込みレベルを得ることができるが、さらに(2)にあるバッファーを使うことにより、交換反応を伴うより高いレベルの取り込み効率が得られる。
  9. 高濃度のATPによりギャップをリン酸化することができる。ニックは効果的にリン酸化されない。

参考文献

  1. Richardson, C.C. (1981).In P.D. Boyer (Ed.), The Enzymes, Vol. 14, (pp.299-314). San Diego: AcademicPress.
  2. Sambrook, J.et al.(1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2nd ed.), (pp 10.59-10.67, 11.31-11.33).Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  3. Cameron, V. and Uhlenbeck, O.C. (1977) Biochemistry,16, 5120-5126.
  4. Berkner, K.L. and Folk, W.R. (1977) J. Biol. Chem.,252, 3176-3184.
  5. Soltis, D.A. and Uhlenbeck, O.C. (1982) J. Biol. Chem.,257, 11332-11339.
  6. Wang, L.K. and Human, S. (2001) J. Biol. Chem.,276, 26868-26874.
  7. Wang, L.K. and Shuman, S. (2002) Nucl.Acids Res., 30, 1073-1080.