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T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligaseカタログ番号:M0202

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

M0202S 20,000 units 400,000 cohesive end units/ml ¥11,000 ¥9,350 -20C
M0202T 20,000 units 2,000,000 cohesive end units/ml ¥11,000 ¥9,350 -20C
M0202L 100,000 units 400,000 cohesive end units/ml ¥44,000 ¥37,400 -20C
M0202M 100,000 units 2,000,000 cohesive end units/ml ¥44,000 ¥37,400 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • DNA修飾酵素&クローニング>リガーゼ&ライゲーションキット

特徴

高効率なライゲーションを可能にする高純度リガーゼ

 

・高純度のリガーゼで夾雑物が最少 
・余分なヌクレアーゼの混入が最少
・高効率なライゲーション反応が可能 

高速・高効率のマスターミックス仕様

リガーゼ・マスターミックス


概要:
2本鎖DNAやRNAの隣接する5'リン酸末端と3'ヒドロキシル末端とのホスホジエステル結合の形成を触媒する。2本鎖DNAだけではなく、RNAもしくはDNA/RNAハイブリッドの平滑末端および付着末端も結合する。また、2本鎖中のニックも修復する 。

 

由来:
E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8から精製。

 

アプリケーション:
・ 制限酵素断片のクローニング
・ リンカーやアダプターを平滑末端DNAに結合

 

付属試薬:

T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)

 

NEBのリガーゼは高純度に精製
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各社から市販されているT4 DNA Ligaseのタンパク質濃度を測定した後、同量のタンパク質をSDS-PAGEに供し、SilverXpressにて銀染色した。MはNEBのBroad Range Protein Marker(NEB #=7702)。

 

NEBのリガーゼはDNAの分解をほとんど生じない:

image

20 nMの蛍光標識DNAと各社バッファー、5 µLの酵素を含む50 µLの反応溶液を37℃で16時間インキュベーションした。続いて80℃にて20分間の熱失活を行い、この内の1 µLをGeneScanTM 120 LIZ Size Standardを含む10 µLのHi Di Formamideと結合させた。これを3130 x 1 Genomic Analyzerに供してTop鎖とBottom鎖のそれぞれの分解効率を測定した。 

酵素特性

ユニット定義:
1ユニットは、全反応溶液20μl中(1XT4 DNAリガーゼ反応バッファー)、16 ℃、30分において、
λDNA-HindIII digest(5'DNA末端濃度で0.12 μM [300 μg/ml])の50%をライゲーションをするために必要な酵素量として定義される。

 

反応条件:
1X T4 DNAリガーゼ反応バッファー [50mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl2、10 mM DTT,、1mM ATP]中にて反応。16℃でインキュベーションをおこなう。

* 推奨反応条件:20 μlの反応系において、400 unitsの酵素の使用を推奨します。この場合M0202Sは50回分に相当します。

 

1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer 組成:
・50 mM Tris-HCl
・10 mM MgCl2
・1 mM ATP
・10 mM Dithiothreitol
pH 7.5 @ 25°C

 

酵素溶液の組成:
50 mM KCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、0.1mM EDTA、1 mM DTTと50% グリセロール。

 

保存温度:

-20 ℃

 

熱による不活性化:
65 ℃で10分間

 

酵素濃度:
400,000 cohesive end units/mlおよび2,000,000 cohesive end units/ml (高濃度)。

メモ

使用上の注意:

  1. ATPは補因子として反応に必須である。NAD+を必要とするE. coli DNAリガーゼと異なる。
  2. T4 DNAリガーゼを希釈して-20 ℃で保存する場合、 50% グリセロール保存バッファー(Diluent Buffer A, NEB #B8001) を使用すること。希釈してすぐに使用する場合は、1X T4 DNAリガーゼ反応バッファーの使用が可能。
  3. 1 mM ATPを添加することにより、NEBuffer 1.1、2.1、3.1およびCutSmart Buffer中でライゲーションが可能。またT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー中でのライゲーション反応が可能。

 

アプリケーション上の注意:

  1. 室温でのライゲーション:
    本リガーゼを用いて室温でライゲーション反応をおこなうことも出来る(20-25°C)。このとき、突出末端のライゲーションであれば、20uL中、1 µl のリガーゼを使用して10分間の反応をおこなう。平滑末端の場合、20 µl中、1uLのリガーゼを使用して2時間、あるいは1uLの高濃度リガーゼを用いて10分間反応をおこなうこと。
  2. Quick Ligation Kit (NEB #M2200S, [30 reactions] or NEB #M2200L, [150 reactions])を用いた場合、突出末端・平滑末端のいずれにおいても室温下で5分間でライゲーションをおこなうことが出来る。

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