T4 DNA Ligase
カタログ番号 |
サイズ |
濃度 |
価格 |
保存温度 |
|---|---|---|---|---|
| M0202S | 20,000 units | 400,000 cohesive end units/ml | ¥11,200 | -20C |
| M0202T | 20,000 units | 2,000,000 cohesive end units/ml | ¥11,200 | -20C |
| M0202L | 100,000 units | 400,000 cohesive end units/ml | ¥44,700 | -20C |
| M0202M | 100,000 units | 2,000,000 cohesive end units/ml | ¥44,700 | -20C |
製品カテゴリ>グループ
- ＤＮＡ修飾酵素&クローニング>リガーゼ＆ライゲーションキット
特徴
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高効率なライゲーションを可能にする高純度リガーゼ
・高純度のリガーゼで夾雑物が最少 |
高速・高効率のマスターミックス仕様 |
概要：
2本鎖DNAやRNAの隣接する5'リン酸末端と3'ヒドロキシル末端とのホスホジエステル結合の形成を触媒する。2本鎖DNAだけではなく、RNAもしくはDNA/RNAハイブリッドの平滑末端および付着末端も結合する。また、2本鎖中のニックも修復する 。
由来：
E. coli C600 pcl857 pPLc28 lig8から精製。
アプリケーション:
・ 制限酵素断片のクローニング
・ リンカーやアダプターを平滑末端DNAに結合
付属試薬：
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
NEBのリガーゼは高純度に精製：
各社から市販されているT4 DNA Ligaseのタンパク質濃度を測定した後、同量のタンパク質をSDS-PAGEに供し、SilverXpressにて銀染色した。MはNEBのBroad Range Protein Marker(NEB #=7702)。
NEBのリガーゼはDNAの分解をほとんど生じない：
20 nMの蛍光標識DNAと各社バッファー、5 µLの酵素を含む50 µLの反応溶液を37℃で16時間インキュベーションした。続いて80℃にて20分間の熱失活を行い、この内の1 µLをGeneScanTM 120 LIZ Size Standardを含む10 µLのHi Di™ Formamideと結合させた。これを3130 x 1 Genomic Analyzerに供してTop鎖とBottom鎖のそれぞれの分解効率を測定した。
プロトコール
酵素特性
ユニット定義:
1ユニットは、全反応溶液20μl中(1XT4 DNAリガーゼ反応バッファー)、16 ℃、30分において、λDNA-HindIII digest(5'DNA末端濃度で0.12 μM [300 μg/ml])の50%をライゲーションをするために必要な酵素量として定義される。
反応条件:
1X T4 DNAリガーゼ反応バッファー [50mM Tris-HCl (pH 7.5)、10 mM MgCl2、10 mM DTT,、1mM ATP]中にて反応。16℃でインキュベーションをおこなう。
* 推奨反応条件：20 μlの反応系において、400 unitsの酵素の使用を推奨します。この場合M0202Sは50回分に相当します。
1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer 組成:
・50 mM Tris-HCl
・10 mM MgCl2
・1 mM ATP
・10 mM Dithiothreitol
pH 7.5 @ 25°C
酵素溶液の組成:
50 mM KCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、0.1mM EDTA、1 mM DTTと50% グリセロール。
保存温度：
-20 ℃
熱による不活性化:
65 ℃で10分間
酵素濃度:
400,000 cohesive end units/mlおよび2,000,000 cohesive end units/ml (高濃度)。
メモ
使用上の注意:
- ATPは補因子として反応に必須である。NAD+を必要とするE. coli DNAリガーゼと異なる。
- T4 DNAリガーゼを希釈して-20 ℃で保存する場合、 50% グリセロール保存バッファー(Diluent Buffer A, NEB #B8001) を使用すること。希釈してすぐに使用する場合は、1X T4 DNAリガーゼ反応バッファーの使用が可能。
- 1 mM ATPを添加することにより、NEBuffer 1.1、2.1、3.1およびCutSmart Buffer中でライゲーションが可能。またT4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー中でのライゲーション反応が可能。
アプリケーション上の注意：
- 室温でのライゲーション:
本リガーゼを用いて室温でライゲーション反応をおこなうことも出来る(20-25°C)。このとき、突出末端のライゲーションであれば、20uL中、1 µl のリガーゼを使用して10分間の反応をおこなう。平滑末端の場合、20 µl中、1uLのリガーゼを使用して2時間、あるいは1uLの高濃度リガーゼを用いて10分間反応をおこなうこと。 - Quick Ligation Kit (NEB #M2200S, [30 reactions] or NEB #M2200L, [150 reactions])を用いた場合、突出末端・平滑末端のいずれにおいても室温下で5分間でライゲーションをおこなうことが出来る。
