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NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illuminaカタログ番号:E7760

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E7760S 24 reactions ¥161,700 -20C
E7760L 96 reactions ¥524,300 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用(DNA, ChIP, mRNA, Small RNA)

特徴

NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit はイルミナ用 RNA ライブラリー調製試薬である (ディレクショナルタイプ、Stranded)。RNA から合成された cDNA(2 本鎖)の 第 1 鎖だけからライブラリーが調製されるため、シーケンスリードは元の RNA の方向性を保っている。センス鎖、アンチセンス鎖のどちらから転写されたかを区別して解析する場合や、アッセンブルする場合に効果的であり、最近の RNA シーケンス用ライブラリー調製の主流である。

 

通常、ポリA-mRNA 精製キットまたは rRNA 除去キットの前処理キット (別売) と併用してライブラリー調製を行う。この場合、5 ng - 1 µg Total RNA から、約 5.5 時間でライブラリー調製ができる。


非ディレクショナルな  RNA ライブラリー調製を行う場合には、NEBNext Ultra II RNA Library Prep kit (NEB #E7770) を使用する。

 
特長:
 ・ ディレクショナル (Stranded) 用 RNA ライブラリー調製キット

 ・ 微量かつ広域の Total RNA からライブラリー調製

      - rRNA 除去キットを併用した場合 : 5 ng - 1 µg Total RNA

      - mRNA 精製キットを併用した場合 : 10 ng - 1 µg Total RNA

      - 前処理をしない場合 (RNA ウイルスゲノムシーケンスなど) : 5 ng - 1 µg Total RNA (サンプルによって異なる)

 ・ 高効率な cDNA 合成とアダプターライゲーション、最小限の PCR サイクル数により、低バイアスでライブラリー調製

 ・ トランスクリプトームを正しく反映した RNA ライブラリーが調製できるため、遺伝子発現解析に最適

 ・ 短時間かつ最小限のハンズオンで調製、自動化にも対応
 ・ 各ステップの試薬はモジュールとして購入可能
 ・ 6,000 報以上の論文実績 (NEBNext 全体)、サンガー研究所など世界各地の大型センターで導入
 ・ cDNA 精製ビーズ付きキットも別途販売中(NEB #E7765
 

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インプットサンプル :
トータル RNA、精製済み mRNA、rRNA 除去済み RNA
 
前処理の選択 :
生物種、解析対象、分解度などから選択。以下ガイドを参照する。

 

 生物種 *  解析対象 RNA  RNA の分解度  推奨の前処理キット
 ヒト・マウス・ラット  mRNA

 分解なし (RIN > 7)

 mRNA 精製キット

 (#E7490)

 mRNA **

 分解あり (RIN < 7)

 rRNA 除去キット

 (#E7400 または #E6310)

 mRNA (グロビン mRNA 以外)

 分解度は問わない

 rRNA & グロビン mRNA 除去キット

 (#E7750)

 mRNA + ncRNA

 (small RNA 以外 ***)

 分解度は問わない

 rRNA 除去キット

 (#E7400 または #E6310)

 真核生物  mRNA (ポリA型)

 分解なし (RIN > 7)

 mRNA 精製キット

 (#E7490)

 バクテリア

 mRNA (非ポリA型)

 分解度は問わない

 rRNA 除去キット

 (#E7850)

 RNA ウイルス  ゲノムRNA  分解度は問わない

 必要なし ****

 

   * 表中に記載されていない生物種や解析対象に対応する前処理キットは、取り扱いなし (例:昆虫の rRNA 除去キット)

   ** mRNA の他、ncRNA も検出される

   *** Small RNA ライブラリー調製には #E7300 を推奨

   **** ホスト RNA が混入している場合は rRNA 除去キットなどの前処理が効果的

 
 
イルミナ社対応シーケンサー:

 ・非整列化フローセルタイプ : MiSeq、MiniSeq、NextSeq 550、HiSeq 2500

 ・整列化フローセルタイプ : iSeq 100、NextSeq 2000、HiSeq 3000/4000、HiSeq X、NovaSeq 6000

 

 

 Figure 1.  Ultra II RNA Directional ライブラリー調製のワークフロー:

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Figure 2.  広域インプット量から高収量でライブラリーを調製

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ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) から polyA-mRNA を精製、各社キットおよび推奨プロトコールを用いてライブラリー調製をおこなったところ (n=3)、どのインプット量においても NEBNext のほうが高い収量であることが示された。キットは図内上部、PCR サイクル数は下部に示している。

 ライブラリー収量の追加データ

 

 

Figure 3.  どのインプット量でも均一なリード GC 含量分布を示す

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ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) から polyA-mRNA を精製、各社キットおよび推奨プロトコールを用いてライブラリー調製をおこない、NextSeq 500 でシーケンスをした (2 x 76 bp、n=3)。リードを hg 19 リファレンスゲノムにマッピングして GC 含量分布を調べた結果、NEBNext ではどのインプット量においても 均一な分布を示した。このことは、インプット量によるライブラリー調製バイアス (シーケンスバイアス) がないことを示している。

 

ライブラリークオリティーの追加データ

 

 

Figure 4.  転写産物全長を均一にカバー

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ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) から各社キットおよび推奨プロトコールを用いて polyA-mRNA を精製、ライブラリー調製をして、NextSeq® 500 でシーケンスした (2 x 76 bp)。得られたリードから RefSeq transcripts の 5' から 3' 末端のカバレッジを調べた結果、どのインプット量からも均一性が確認された。特に NEBNext では 10 ng の微量インプットの時にも 3' 末端側の均一性が低下することは無かった。

転写産物カバレッジの追加データ

 

 

Figure 5.  微量インプットから調製したライブラリーもトランスクリプトームの複雑性を維持、正確な発現解析が可能

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ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) から各社キットおよび推奨プロトコールを用いて polyA-mRNA を精製、ライブラリー調製をして、NextSeq® 500 でシーケンスした (2 x 76 bp)。Salmon 0.4.0 でリードマッピングと GENCODE v25 転写産物の定量を行った結果、インプット量によらず転写産物の複雑性が維持されていることが示された。これはバイアスなく、インプット中の転写産物を正確に反映した状態でライブラリー調製が行われていることを意味しており、微量インプットでも正確な遺伝子発現解析ができることを示している。

 

ライブラリー複雑性の追加データ

 

 

Figure 6. FFPE RNA (分解が進んだ RNA) でも rRNA 残存が少ないライブラリー調製が可能

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ヒト肝臓組織FFPE由来のトータルRNA (Biochain # R2234149. RIN 2.5) から各社キットおよび推奨プロトコールを用いて rRNA を除去、ライブラリー調製をして、NextSeq® 500 でシーケンスした (2 x 76 bp)。mirabait 4.9 を用いて rRNA (18S、28S、5S、5.8S、16S、12S) と 6 塩基ないしは 32 以上の塩基の相同性があるリードを rRNA リードとして検出した。クオリティーフィルタリングを行ったトータルリード中の rRNA リードの割合をもって rRNA 残存率とした。結果、NEB キットが高い rRNA 除去率を示した。使用したキットは以下のとおりである。

 

・NEBNext Ultra II Directional RNA Kit + NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)

・Kapa Stranded RNA-Seq Kit + RiboErase

・Kapa HyperPrep Kit + RiboErase

・Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit + Ribo-Zero™ Gold.

 

 

Figure 7. FFPE RNA から調製したライブラリーも転写産物 (AP000769.1-201) を均一にカバー

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ヒト肝臓組織FFPE由来のトータルRNA (Biochain # R2234149. RIN 2.5) から各社キットおよび推奨プロトコールを用いて rRNA を除去、ライブラリー調製をして、NextSeq® 500 でシーケンスした (2 x 76 bp)。得られたリードを GENCODE v25 transcripts にマッピング、転写産物長に合わせて 5'→3' の塩基位置を 0 → 100 % として個々の転写産物 (ENST00000625158.1; AP000769.1-201) をノーマライズして転写産物位置におけるカバレッジを解析した。結果、NEBNext はインプット量によらず、転写産物全長を均一にカバーしていることが示された。各社キットは以下のとおりである。


・NEBNext Ultra II Directional RNA Kit + NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)

・Kapa Stranded RNA-Seq Kit + RiboErase

・Kapa HyperPrep Kit + RiboErase

・Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit + Ribo-Zero™ Gold.

 

FFPE RNA サンプルのライブラリー調製の追加データ

日本語マニュアル

日本語マニュアル

* 本マニュアルはオリジナル英語マニュアル version 3.1 に基づいて作成されています。

   製品のご使用にあたり、必ず最新の英語マニュアルをご確認ください。

別途必要な試薬等

前処理キット
  - NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module
    マグネティックビーズにより mRNA(ポリA+RNA)を精製 
     
  - NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Human/Mouse/Rat) New!
    ヒト、マウス、ラットのトータル RNA から細胞質 rRNA およびミトコンドリア rRNA を除去
    FFPE由来RNA など劣化が進行した RNA からも高効率で除去
    オリジナルバージョン も販売継続 (#E6310)
     
  - NEBNext Globin & rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)
    ヒト、マウス、ラットのトータル RNA からグロビン mRNA と rRNA を除去
    FFPE由来RNA など劣化が進行した RNA からも高効率で除去
     
  - NEBNext rRNA Depletion Kit (Bacteria)
    バクテリアの 5S、16S、23S rRNA を高効率で除去
    グラム陰性菌および陽性菌に対応
   
アダプターオリゴ
   

DNA精製ビーズ (SPRIselect® beads、AMPure® XP Beads (Beckman Coulter, Inc.) を推奨) 

またはDNA精製ビーズ付属キットを使用

   
マグネットラック(#S1515S
   

ライブラリー定量キット(qPCR)

キット内容

・NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix *1

・NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer *1

・Random Primers *1

・NEBNext Second Strand Synthesis Enzyme Mix *2

・NEBNext Second Strand Synthesis Reaction Buffer with dUTP Mix *2

・NEBNext USER Enzyme *2

・NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix *3

・NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer *3

・NEBNext Ultra II Ligation Master Mix *4

・NEBNext Ligation Enhancer *4

・NEBNext Adaptor Dilution Buffer *4

・NEBNext Ultra II Q5 Master Mix *5

・Nuclease-free Water

・0.1X TE Buffer

 

* アダプターオリゴは別売

*1 NEBNext Ultra II RNA First Strand Synthesis Module として別途購入可能

*2 NEBNext Ultra II Directional RNA Second Strand Synthesis Module として別途購入可能

*3 NEBNext Ultra II DNA Module (#E7546)  として別途購入可能

*4 NEBNext Ultra II Ligation Module (#E7595) として別途購入可能

*5 NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (#M0544) として別途購入可能