NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit はイルミナ用 RNA ライブラリー調製試薬である (非ディレクショナルタイプ)。

通常、ポリA-mRNA 精製キットまたは rRNA 除去キットの前処理キット (別売) と併用してライブラリー調製を行う。この場合、5 ng - 1 µg Total RNA から、約 5.5 時間でライブラリー調製ができる。

ディレクショナルな (Stranded) RNA ライブラリー調製を行う場合には、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep kit (NEB #E7760) を使用する。

 ・ 微量かつ広域の Total RNA からライブラリー調製

      - rRNA 除去キットを併用した場合 : 5 ng - 1 µg Total RNA

      - mRNA 精製キットを併用した場合 : 10 ng - 1 µg Total RNA

      - 前処理をしない場合 (RNA ウイルスゲノムシーケンスなど) : 5 ng - 1 µg Total RNA (サンプルによって異なる)

 ・ トランスクリプトームを正しく反映した RNA ライブラリーが調製できるため、遺伝子発現解析に最適

   * 表中に記載されていない生物種や解析対象に対応する前処理キットは、取り扱いなし (例：昆虫の rRNA 除去キット)

   ** mRNA の他、ncRNA も検出される

   *** Small RNA ライブラリー調製には #E7300 を推奨

   **** ホスト RNA が混入している場合は rRNA 除去キットなどの前処理が効果的

 ・非整列化フローセルタイプ ： MiSeq、MiniSeq、NextSeq 550、HiSeq 2500

 ・整列化フローセルタイプ ： iSeq 100、NextSeq 2000、HiSeq 3000/4000、HiSeq X、NovaSeq 6000

ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) から polyA-mRNA を精製、各社キットおよび推奨プロトコールを用いてライブラリー調製をおこなったところ (n=3)、どのインプット量においても NEBNext のほうが高い収量であることが示された。キットは図内上部、PCR サイクル数は下部に示している。

 ライブラリー収量の追加データ

ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) から各社キットおよび推奨プロトコールを用いて rRNA を除去、ライブラリー調製をして、NextSeq® 500 でシーケンスした (2 x 76 bp)。リードを hg19 リファレンスゲノムにマッピング、RSeQC の Read Duplication Tool を使用して同じゲノム領域にマッピングされたリード割合を Duplication rate とした。それぞれの調製で使用したキットは以下の通り：

(緑色) NEBNext : NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/ Mouse/Rat) + NEBNext Ultra II RNA Kit

(茶色) Illumina : Illumina Ribo-Zero™ Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) + Illumina TruSeq RNA Library Prep Kit v2

ライブラリークオリティーの追加データ

Figure 4.  転写産物全長を均一にカバー

ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) から各社キットおよび推奨プロトコールを用いて polyA-mRNA を精製、ライブラリー調製をして、NextSeq® 500 でシーケンスした (2 x 76 bp)。得られたリードから RefSeq transcripts の 5' から 3' 末端のカバレッジを調べた結果、どのインプット量からも均一性が確認された。特に NEBNext では 10 ng の微量インプットの時にも 3' 末端側の均一性が低下することは無かった。ライブラリー調製に使用したキットは以下のとおり：

（緑色）NEBNext : NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module + NEBNext Ultra II RNA Kit

（茶色）TruSeq: TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2

転写産物カバレッジの追加データ

ヒト・リファレンス RNA (Agilent #740000) に ERCC RNA Spike-In Mix I (Thermo Fisher Scientific #4456740) を添加したものをインプットとして、異なる量から NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) で rRNA 除去、NEBNext Ultra II RNA Kit でライブラリー調製を行った。NextSeq® 500 でシーケンス (2 x 76 bp)、Salmon 0.4.0 でリードマッピングと ERCC 転写物の定量を行った結果、インプット量に寄らず転写産物の複雑性が維持されていることが示された。これはバイアスなく、インプット中の転写産物を正確に反映した状態でライブラリー調製が行われていることを意味しており、微量インプットでも正確な遺伝子発現解析ができることを示している。

A. ヒト・リファレンス RNA のインプット量間の TPM (Transcripts Per Kilobase Million) 相関解析

B. ERCC 転写産物のインプット量間の TPM (Transcripts Per Kilobase Million) 相関解析

ライブラリー複雑性の追加データ