NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit はイルミナ用 DNA ライブラリー調製試薬である。DNA 断片化酵素が含まれているため、インタクトなゲノム DNA からライブラリー調製ができる。さらに DNA 断片化とEnd repair/dA-tailing 反応、アダプターライゲーションまでを 1 チューブで行うので、実験手順が簡単な上、DNA のロスがなく、100 pg の DNA より高収量でライブラリー調製をすることができる。

インプット DNA として、断片化されていないインタクトなゲノム DNA や、サイズが大きい PCR アンプリコンなどを使用する。なお、断片化済み ゲノムDNA や ChIP DNA、サイズの小さい PCR からアンプリコンからのライブラリー調製には適していないので、その場合は別キット (#E7645) を使用する。

・ 酵素的断片化は物理的断片化よりも酸化ダメージや塩基置換リスクが少ない

・分解があまり進行していない FFPE DNA

・非整列化フローセルタイプ ： MiSeq、MiniSeq、NextSeq 550、HiSeq 2500

・整列化フローセルタイプ ： iSeq 100、NextSeq 2000、HiSeq 3000/4000、HiSeq X、NovaSeq 6000

Figure 1. 広域インプット量からライブラリーを調製

各社キットおよび推奨プロトコールを用いて、ヒト NA19240 ゲノム DNA からライブラリーを調製した (3-6 replicates、2 名)。インプット量および PCR サイクル数を図中に示す。結果、どの DNA 量においても NEBNext が最も高い収量でライブラリー調製ができることが示された。

Kapa HyperPlus で調製をする際は、マニュアルに従って、事前にインプット DNA を 3x ビーズでクリーンアップ、20 分間で断片化した。

Illumina Nextera での調製では、インプット量を 50 ng に調整する必要があるため、ライブラリー収量データは 1 つである（図中、オレンジ色) 。

コバリスでの断片化は、1x TE バッファー中、~200 bp となるようにマニュアルに従って条件設定をした。断片化後は NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (#E7645) で調製をした。

100 pg - 200 ng の各量のヒト NA19240 ゲノム DNA を断片化、ライブラリー調製をおこなった。結果、NEBNext ではインプット DNA 量によらず、一定したサイズで断片化できることが示された。なお NEBNext Ultra II FS　 では 20 分間で断片化をおこなった。Kapa™ HyperPlus では推奨マニュアルに従って、事前にインプット DNA を 3X ビーズでクリーンナップ、20分間で断片化した。調製したライブラリーは Agilent® Bioanalyzer® で測定した (1 ng 以下のインプット由来のライブラリーは希釈なしでアプライ、それ以外は 0.1X TE で 5 倍希釈してアプライ)。

100 ng のヒト NA19240 ゲノム DNA をインプットとして、各時間における断片化サイズを調べた。断片化は 37 ℃ で実施、続いて 65 ℃ で 30 分間のインキュベーション (end repair と dA テーリング) を行った後、ビーズ精製をして Agilent® Bioanalyzer® で解析をした。結果、反応時間による断片化サイズの調整ができることが示された。

各社のライブラリー調製試薬および断片化方法を比較した結果、NEBNext Ultra II FS キットが最も低バイアスの GC カバレージをもたらすことが示された。ライブラリーは 1 ng のゲノム DNA（3 種類の微生物）より調製、イルミナ社の NGS 機器で解析した。リードはBowtie 2.2.4 によりマッピング、GC カバレージは Picard’s CollectGCBiasMetrics （v1.117）により算出した。NEBNext Ultra II FS キットのカバレージは 3 種類の微生物ゲノム DNA（GC 含量 38、51、65%）において、1.0 付近にプロット（緑線）されており、GC バイアスが低いことが表されている。

物理的に断片化（超音波破砕）した DNA とNEBNext Ultra II FS キット（酵素的断片化）で調製したライブラリーを比較した結果、Ultra II FSキットで調製したライブラリーでは、酸化ダメージ・マーカーの塩基置換の頻度が低いことが示された。一方、物理的に断片化したDNA より調製したライブラリーでは C>A および G>Tの塩基置換が高い頻度で検出され、断片化中に DNA が酸化によりダメージを受けている可能性が示唆された。ライブラリーは 1ng および 100 ng のヒト NA19240 ゲノムDNA より調製し、イルミナ社の NGS 機器で解析した。723M のリードよりランダムに抽出されたリードを GRCh38リファレンス DNA にアライメントして解析した。

Human genomic DNA was subjected to DNA library construction using an existing DNA library construction workflow (CURRENT), NEB Ultra II or NEB Ultra II FS.  Adapter-Ligated libraries were amplified by PCR (4-12 cycles), purified and quantitated using the Agilent Bioanalyzer platform. Values obtained were used to normalize DNA library yield from 12 cycles of PCR.

View additional data  presented at AGBT by Peter Ellis, Senior Staff Scientist at the Wellcome Trust Sanger Institute.