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NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep with Sample Purification Beads

NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep with Sample Purification Beadsカタログ番号:E6177

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E6177S 24 reactions ¥132,000 -20C / 室温
E6177L 96 reactions ¥459,000 -20C / 室温

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用(DNA, ChIP, mRNA, Small RNA)

特徴

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit はイルミナ用 DNA ライブラリー調製試薬である。DNA 断片化酵素が含まれているため、インタクトなゲノム DNA からライブラリー調製ができる。さらに DNA 断片化とEnd repair/dA-tailing 反応、アダプターライゲーションまでを 1 チューブで行うので、実験手順が簡単な上、DNA のロスがなく、100 pg の DNA より高収量でライブラリー調製をすることができる。

 

インプット DNA として、断片化されていないインタクトなゲノム DNA や、サイズが大きい PCR アンプリコンなどを使用する。なお、断片化済み ゲノムDNA や ChIP DNA、サイズの小さい PCR からアンプリコンからのライブラリー調製には適していないので、その場合は別キット (#E7645) を使用する。

 
特長:
・ DNA 断片化が組み込まれたライブラリー調製キット
・ DNA の種類や GC 含量、サンプルバッファーに依存せず、低バイアスで断片化
・ 100 pg - 500 ng の広域インプット量 から調製

・ 酵素的断片化は物理的断片化よりも酸化ダメージや塩基置換リスクが少ない

・ ビーズ精製は 2 回、わずか15 分のハンズオンで調製、自動化にも対応
・ 各ステップの試薬はモジュールとして購入可能
・ 6,000 報以上の論文実績 (NEBNext 全体)、サンガー研究所など世界各地の大型センターで導入
・ DNA 精製ビーズ付きキット
 

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インプットサンプル : 未切断またはサイズが大きい 2 本鎖 DNA
・非断片化ゲノム DNA
・サイズが大きい PCR アンプリコン
・完全長 cDNA

・分解があまり進行していない FFPE DNA

 など
 
イルミナ社対応シーケンサー:

・非整列化フローセルタイプ : MiSeq、MiniSeq、NextSeq 550、HiSeq 2500

・整列化フローセルタイプ : iSeq 100、NextSeq 2000、HiSeq 3000/4000、HiSeq X、NovaSeq 6000

 

 

Figure 1. 広域インプット量からライブラリーを調製

 

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各社キットおよび推奨プロトコールを用いて、ヒト NA19240 ゲノム DNA からライブラリーを調製した (3-6 replicates、2 名)。インプット量および PCR サイクル数を図中に示す。結果、どの DNA 量においても NEBNext が最も高い収量でライブラリー調製ができることが示された。

 

Kapa HyperPlus で調製をする際は、マニュアルに従って、事前にインプット DNA を 3x ビーズでクリーンアップ、20 分間で断片化した。


Illumina Nextera での調製では、インプット量を 50 ng に調整する必要があるため、ライブラリー収量データは 1 つである(図中、オレンジ色) 。


コバリスでの断片化は、1x TE バッファー中、~200 bp となるようにマニュアルに従って条件設定をした。断片化後は NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (#E7645) で調製をした。

 

 

Figure 2. インプット量に依存せずに DNA を断片化

 

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100 pg - 200 ng の各量のヒト NA19240 ゲノム DNA を断片化、ライブラリー調製をおこなった。結果、NEBNext ではインプット DNA 量によらず、一定したサイズで断片化できることが示された。なお NEBNext Ultra II FS  では 20 分間で断片化をおこなった。Kapa™ HyperPlus では推奨マニュアルに従って、事前にインプット DNA を 3X ビーズでクリーンナップ、20分間で断片化した。調製したライブラリーは Agilent® Bioanalyzer® で測定した (1 ng 以下のインプット由来のライブラリーは希釈なしでアプライ、それ以外は 0.1X TE で 5 倍希釈してアプライ)。

 

 

Figure 3. 反応時間で断片化サイズを調整

 

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100 ng のヒト NA19240 ゲノム DNA をインプットとして、各時間における断片化サイズを調べた。断片化は 37 ℃ で実施、続いて 65 ℃ で 30 分間のインキュベーション (end repair と dA テーリング) を行った後、ビーズ精製をして Agilent® Bioanalyzer® で解析をした。結果、反応時間による断片化サイズの調整ができることが示された。

 

 

Figure 4. GC 含量に依存せず低バイアスなカバレッジを実現

 

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各社のライブラリー調製試薬および断片化方法を比較した結果、NEBNext Ultra II FS キットが最も低バイアスの GC カバレージをもたらすことが示された。ライブラリーは 1 ng のゲノム DNA(3 種類の微生物)より調製、イルミナ社の NGS 機器で解析した。リードはBowtie 2.2.4 によりマッピング、GC カバレージは Picard’s CollectGCBiasMetrics (v1.117)により算出した。NEBNext Ultra II FS キットのカバレージは 3 種類の微生物ゲノム DNA(GC 含量 38、51、65%)において、1.0 付近にプロット(緑線)されており、GC バイアスが低いことが表されている。

 

 

Figure 5. 最小限のダメージで DNA を断片化

 

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物理的に断片化(超音波破砕)した DNA とNEBNext Ultra II FS キット(酵素的断片化)で調製したライブラリーを比較した結果、Ultra II FSキットで調製したライブラリーでは、酸化ダメージ・マーカーの塩基置換の頻度が低いことが示された。一方、物理的に断片化したDNA より調製したライブラリーでは C>A および G>Tの塩基置換が高い頻度で検出され、断片化中に DNA が酸化によりダメージを受けている可能性が示唆された。ライブラリーは 1ng および 100 ng のヒト NA19240 ゲノムDNA より調製し、イルミナ社の NGS 機器で解析した。723M のリードよりランダムに抽出されたリードを GRCh38リファレンス DNA にアライメントして解析した。

 

 

Figure 6. 他社ライブラリー調製キットよりも 10 - 15 x の高いライブラリー収量 (サンガー研究所提供データ)

 

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Human genomic DNA was subjected to DNA library construction using an existing DNA library construction workflow (CURRENT), NEB Ultra II or NEB Ultra II FS.  Adapter-Ligated libraries were amplified by PCR (4-12 cycles), purified and quantitated using the Agilent Bioanalyzer platform. Values obtained were used to normalize DNA library yield from 12 cycles of PCR.

View additional data  presented at AGBT by Peter Ellis, Senior Staff Scientist at the Wellcome Trust Sanger Institute. 

日本語マニュアル

日本語マニュアル

* 本マニュアルはオリジナル英語マニュアル version 2.2 に基づいて作成されています。

   製品のご使用にあたり、必ず最新の英語マニュアルをご確認ください。

別途必要な試薬等

アダプターオリゴ

・マグネットラック (NEB #S1515S) など

キット内容

・NEBNext Ultra II FS Enzyme Mix *1

・NEBNext Ultra II FS Reaction Buffer *1

・NEBNext Ultra II Ligation Master Mix *2

・NEBNext Ligation Enhancer *2

・NEBNext Ultra II Q5 Master Mix *3


*アダプターオリゴは別売

*1 NEBNext Ultra II FS DNA Module (#E7810)  として別途購入可能

*2 NEBNext Ultra II Ligation Module (#E7595) として別途購入可能

*3 NEBNext Ultra II Q5 Master Mix (#M0544) として別途購入可能