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NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs)

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) カタログ番号:E6440

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E6440S 96 rxns ¥83,200 ¥74,880 -20C
E6440L 384rxns ¥299,000 ¥269,100 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用アダプターオリゴ

備考

  • 備考:2022年度末キャンペーン (2022/11/29~2023/1/31)、価格改定 (2022年10月1日) 

特徴

Illumina用 アダプターオリゴ


特長:

・ループ状アダプターとユニーク・デュアル・インデックス・プライマーが付属

・最大 96 プレックス解析

E6442E6444E6446E6448と併用すれば最大 480 プレックス解析が可能

・ユニークなインデックス・プライマーペアにより、インデックス・ホッピングを低減

・96 ウェルプレートで提供、1 ウェルに i5 と i7 インデックス・プライマーがプレミックス済み

 

Figure 1. アダプターオリゴの付加手順
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NEBのアダプターオリゴは1本鎖DNAがループを形成した構造をとっており、頂点部にウラシル残基を保有します。アダプターライゲーション後にUSER Enzymeを加えて15分間処理することにより、ウラシルが切断されてPCRで増幅可能な断片となります。インデックスやP5、P7配列はPCR反応の際に付加されます。PCRフリーのアプリケーションには対応していません。

 

 

Figure 2: ループ状アダプターによりライブラリー収量を向上、かつアダプターダイマーを低減
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NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) と IDT® for Illumina® –TruSeq® DNA UD Indexes (Illumina # 20022370) を用いてライブラリー調製を行ったところ、NEBNext ループ状アダプターを用いた方がライブラリー収量が高く、アダプターダイマーが少ないことを示された。100 ng の ヒト NA 19240 ゲノム DNA (Coriell Institute) を使用、NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (#E7805) で 8 個ずつ、計 16 個のライブラリー調製を行った。調製最後の PCR を 4 サイクルで実施、クリーンアップした後に Agilent® TapeStation® 4000 で測定した。


A) 平均ライブラリー収量。IDT 社の Y 字状アダプターよりも NEBNext ループ状アダプターを使用したほうが約 60 % ライブラリー収量が高かった。


B) 16 個のライブラリーの TapeStation 解析結果。オレンジ色の矢印で示したバンドがアダプターダイマーを示す。IDT 社の Y 字状アダプターを使用した場合にはアダプターダイマーの発生が観察されたが、NEBNext ループ状アダプターでは一切観察されなかった。

 

 

Figure 3: 96 種類のプライマーペアは偏りなくライブラリーを調製

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キット内の 96 種類すべてのプライマーペアを使用して、同じゲノム DNA サンプルから NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (#E7805) でライブラリー調製、それらを等モルでプールして NovaSeq 6000 でシーケンスした (2 x 150 bp)。総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 1.04 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。このことは、プライマーペアによる増幅の偏りがないことを示す。

 

 

Figure 4: 96 種類のプライマーペアはサンプルによらず均一にライブラリーを調製
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ヒト NA19240 ゲノム DNA (Coriell Institute) をインプットとして (RNA はヒト・リファレンス・トータル RNA)、NEBNext 96 Unique Dual Index Primer Pairs を使用して、以下の異なる 5 種類の方法でライブラリー調製とシーケンスを行った。5 種類の方法は以下のとおりである。


 ・NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (酵素的断片化、ゲノム解析)

 ・Covaris-sheared DNA with the NEBNext Ultra II DNA library prep kit (物理的断片化、ゲノム解析)

 ・NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit (物理的断片化、酵素変換、全ゲノムメチル化解析)

 ・Ultra II DNA library prep kit combined with bisulfite conversion (物理的断片化、バイサルファイト変換、全ゲノムメチル化解析)

 ・NEBNext Ultra II Directional RNA library prep kit (トランスクリプトーム解析)


それぞれ 96 種類のインデックスペアを用いてライブラリー調製 (n=2)、Agilent® TapeStation® 4200でライブラリー QC を実施、等モルでプールしてシーケンス、総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 1.04 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。このことは、どのようなライブラリー調製においても均一にライブラリーを調製できること、プライマーペアによる増幅の偏りがないことを示す。 


 

Figure 5: ユニーク・デュアル・インデックスはインデックス・ホッピングで生じたリードを検出・除外可能

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NEBNext Ultra II FS DNA Kit で調製した 96 個のライブラリーを等モルでプールして NovaSeq 6000 (2x150 bp) と MiSeq® (2 x 76 bp) でシーケンス (Figure 2 で調製したライブラリーを使用)した。得られたリードを Picard Extract Illumina Barcodes tools で demultiplex して以下のカテゴリでリードを分類した。

 

-Demultiplexed reads: 各ライブラリー調製に使用した i5 / i7 インデックスペアが検出された問題がないリード

-Identified index hopping: 各ライブラリー調製に使用した i5 / i7 インデックスペアとは異なるペアが検出されたリード。これがインデックス・ホッピングが起きたものである。

-Dark clusters: N または G リード (4-color ケミストリーのため、MiSeq では認識されない)

-Phi X: universal primer sequence にマッチしないリード (MiSeq experiment には存在しない)

-Other: 上記に該当しないリード


Demultiplexing の結果、NovaSeq で ~5% のリードが、MiSeq で 0.6% のリードがインデックス・ホッピング・リードとして検出された。ユニーク・ペアではない場合にはこれらを検出できないが、ユニーク・ペアでは検出して除外することができ、より正確なドライ解析が可能となる。

 

Figure 6: 他キットとの併用で最大 384 プレックスが可能、均一なリード数を取得可能

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NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB #E7645) と NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 1-4) を使用して、同一のゲノムインプットから 384 種類のライブラリーを調製、等モルでプールして Illumina NovaSeq® 6000 でシーケンス、総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 0.26 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。 

キット内容

・NEBNext Adaptor for Illumina

・USER Enzyme

・10 µM each NEBNext 96 Unique Dual Index Primer Pairs Plate (Set 1) *1 *2

 

*1. 96 穴プレートとして提供、各ウェルにユニークなプライマーペア(プレミックス)が含まれています。

*2. インデックス配列はマニュアルもしくはサンプルシートをご覧ください。