NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) (E6440)

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NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs)

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs)

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) カタログ番号:E6440

カタログ番号	サイズ	濃度	価格	保存温度
E6440S	96 rxns		¥78,700	-20C
E6440L	384rxns		¥282,200	-20C

製品カテゴリ>グループ

NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用アダプターオリゴ

特徴

Illumina用アダプターオリゴ

特長：

・ループ状アダプターとユニーク・デュアル・インデックス・プライマーが付属

・最大 96 プレックス解析

・E6442、E6444、E6446 と併用すれば最大 384 プレックス解析が可能

・ユニークなインデックス・プライマーペアにより、インデックス・ホッピングを低減

・96 ウェルプレートで提供、1 ウェルに i5 と i7 インデックス・プライマーがプレミックス済み

Figure 1. アダプターオリゴの付加手順

NEBのアダプターオリゴは1本鎖DNAがループを形成した構造をとっており、頂点部にウラシル残基を保有します。アダプターライゲーション後にUSER Enzymeを加えて15分間処理することにより、ウラシルが切断されてPCRで増幅可能な断片となります。インデックスやP5、P7配列はPCR反応の際に付加されます。PCRフリーのアプリケーションには対応していません。

Figure 2: ループ状アダプターによりライブラリー収量を向上、かつアダプターダイマーを低減

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) と IDT® for Illumina® –TruSeq® DNA UD Indexes (Illumina # 20022370) を用いてライブラリー調製を行ったところ、NEBNext ループ状アダプターを用いた方がライブラリー収量が高く、アダプターダイマーが少ないことを示された。100 ng のヒト NA 19240 ゲノム DNA (Coriell Institute) を使用、NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (#E7805) で 8 個ずつ、計 16 個のライブラリー調製を行った。調製最後の PCR を 4 サイクルで実施、クリーンアップした後に Agilent® TapeStation® 4000 で測定した。

A) 平均ライブラリー収量。IDT 社の Y 字状アダプターよりも NEBNext ループ状アダプターを使用したほうが約 60 % ライブラリー収量が高かった。

B) 16 個のライブラリーの TapeStation 解析結果。オレンジ色の矢印で示したバンドがアダプターダイマーを示す。IDT 社の Y 字状アダプターを使用した場合にはアダプターダイマーの発生が観察されたが、NEBNext ループ状アダプターでは一切観察されなかった。

Figure 3: 96 種類のプライマーペアは偏りなくライブラリーを調製

キット内の 96 種類すべてのプライマーペアを使用して、同じゲノム DNA サンプルから NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (#E7805) でライブラリー調製、それらを等モルでプールして NovaSeq 6000 でシーケンスした (2 x 150 bp)。総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 1.04 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。このことは、プライマーペアによる増幅の偏りがないことを示す。

Figure 4: 96 種類のプライマーペアはサンプルによらず均一にライブラリーを調製

ヒト NA19240 ゲノム DNA (Coriell Institute) をインプットとして (RNA はヒト・リファレンス・トータル RNA)、NEBNext 96 Unique Dual Index Primer Pairs を使用して、以下の異なる 5 種類の方法でライブラリー調製とシーケンスを行った。5 種類の方法は以下のとおりである。

・NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (酵素的断片化、ゲノム解析)

・Covaris-sheared DNA with the NEBNext Ultra II DNA library prep kit (物理的断片化、ゲノム解析)

・NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit (物理的断片化、酵素変換、全ゲノムメチル化解析)

・Ultra II DNA library prep kit combined with bisulfite conversion (物理的断片化、バイサルファイト変換、全ゲノムメチル化解析)

・NEBNext Ultra II Directional RNA library prep kit (トランスクリプトーム解析)

それぞれ 96 種類のインデックスペアを用いてライブラリー調製 (n=2)、Agilent® TapeStation® 4200でライブラリー QC を実施、等モルでプールしてシーケンス、総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 1.04 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。このことは、どのようなライブラリー調製においても均一にライブラリーを調製できること、プライマーペアによる増幅の偏りがないことを示す。

Figure 5: ユニーク・デュアル・インデックスはインデックス・ホッピングで生じたリードを検出・除外可能

NEBNext Ultra II FS DNA Kit で調製した 96 個のライブラリーを等モルでプールして NovaSeq 6000 (2x150 bp) と MiSeq® (2 x 76 bp) でシーケンス (Figure 2 で調製したライブラリーを使用)した。得られたリードを Picard Extract Illumina Barcodes tools で demultiplex して以下のカテゴリでリードを分類した。

-Demultiplexed reads: 各ライブラリー調製に使用した i5 / i7 インデックスペアが検出された問題がないリード

-Identified index hopping: 各ライブラリー調製に使用した i5 / i7 インデックスペアとは異なるペアが検出されたリード。これがインデックス・ホッピングが起きたものである。

-Dark clusters: N または G リード (4-color ケミストリーのため、MiSeq では認識されない)

-Phi X: universal primer sequence にマッチしないリード (MiSeq experiment には存在しない)

-Other: 上記に該当しないリード

Demultiplexing の結果、NovaSeq で ~5% のリードが、MiSeq で 0.6% のリードがインデックス・ホッピング・リードとして検出された。ユニーク・ペアではない場合にはこれらを検出できないが、ユニーク・ペアでは検出して除外することができ、より正確なドライ解析が可能となる。

Figure 6: 他キットとの併用で最大 384 プレックスが可能、均一なリード数を取得可能

NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB #E7645) と NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 1-4) を使用して、同一のゲノムインプットから 384 種類のライブラリーを調製、等モルでプールして Illumina NovaSeq® 6000 でシーケンス、総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 0.26 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。