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NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF v2)

NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF v2) カタログ番号:E1601

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E1601S 20 rxns ¥21,750 -20C
E1601L 100 rxns ¥58,000 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • DNA修飾酵素&クローニング>クローニングキット

特徴

20+ 断片を一度にクローニング
 
特長

・Golden Gate アッセンブリーに最適化された BsaI-HF v2 を使用(BsmBI-v2 仕様はこちら

・余分な配列を付加しない、シームレスなクローニング
・シングル反応で複数の断片を一度にアッセンブル(2 - 20+)
・シングルインサートのクローニングやライブラリー調製にも利用可能
・GCリッチ配列やリピート配列のアッセンブル
・様々なサイズのDNAをアッセンブル(>15 kb、<100 bp)
・専用の Destibation Plasmid が付属

オンラインツール(Goldengate.neb.com)で簡単にプライマーをデザイン

Ligation Fidelity Tools でアッセンブルデザインをアシスト
 
 
説明:

NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF v2) には BsaI-HF v2 と T4 DNA Ligase の最適化ミックスが含まれている。 BsmBI-v2 は Golden Gate アッセンブリ用に野生型酵素を NEB で改変したものである。これら制限酵素とリガーゼの協調的作用により、複数断片の一括アッセンブルが可能、さらにシングルインサートクローニングやライブラリー作成にも使用できる。キットには pGGAselect destination plasmid が付属しており、アッセンブリのベクターバックボーンに使用できる。


1996 年に開発された Golden Gate 法は余分な配列を付加することなく、複数の DNA 断片を高効率でアッセンブルできる方法である(1、2)。Type IIS 制限酵素と T4 DNA Ligase を使用して複数の DNA 断片をベクターに挿入する。制限反応-ライゲーション反応を繰り返すことによりアッセンブルを行うが(3)、シングルインサートの場合には同時反応もできる(4)。


Type IIS 制限酵素は、認識配列の下流を切断、切断部位は配列依存ではなく認識配列の距離に依存するため、自由に 4 塩基突出末端の配列をデザインできる。例えば、BsaI-HF v2 の認識配列は「GGTCTC (N1/N5)」 であるが、「GGTCTC」が認識配列(制限酵素が結合する領域)であり、その下流 1 塩基(トップ鎖)と 5 塩基(ボトム鎖)が切断部位である。この切断面の 4 塩基突出をアッセンブル付着面に利用する。また切断後の DNA 断片には BsaI-HF v2(Type IIS 制限酵素)の認識配列が残らないため、一旦アッセンブル(ライゲーション)された産物は切断されることは無く、正しいアッセンブル産物だけが得られる。


Golden Gate アッセンブリーは TALEs(5)や TALENs(6)などの複数の DNA 断片のアッセンブリーに良く用いられているが、一般的なシングルインサートのクローニングも可能である。またライブラリー作成や複数の部位特異的挿入にも用いることができる。

 
 

図1. Golden Gate アッセンブリーの原理(BsaI-HF v2 を使用)

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図2. Golden Gate アッセンブリーのワークフロー

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Golden Gate アッセンブリーでは、Type IIS 制限酵素を利用する。本キットでは BsaI-HF v2 を利用、その認識配列(GGTCTC)を 各 2 本鎖 DNA 断片の両末端に付加しておく。この際、切断配列はアッセンブルのために特異的配列をデザインしておく。切断後に生じた 4 塩基突出がアニールしてライゲーション、アッセンブルが完了する。



図3. ベクターマップ

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pGGA ベクター。全長 2,714 bp。クローニングサイトには 2 箇所の BsaI サイトが存在する。