・Golden Gate アッセンブリーに最適化された BsaI-HF v2 を使用（BsmBI-v2 仕様はこちら）

・オンラインツール（Goldengate.neb.com）で簡単にプライマーをデザイン

NEB Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF v2) には BsaI-HF v2 と T4 DNA Ligase の最適化ミックスが含まれている。 BsmBI-v2 は Golden Gate アッセンブリ用に野生型酵素を NEB で改変したものである。これら制限酵素とリガーゼの協調的作用により、複数断片の一括アッセンブルが可能、さらにシングルインサートクローニングやライブラリー作成にも使用できる。キットには pGGAselect destination plasmid が付属しており、アッセンブリのベクターバックボーンに使用できる。

1996 年に開発された Golden Gate 法は余分な配列を付加することなく、複数の DNA 断片を高効率でアッセンブルできる方法である（1、2）。Type IIS 制限酵素と T4 DNA Ligase を使用して複数の DNA 断片をベクターに挿入する。制限反応-ライゲーション反応を繰り返すことによりアッセンブルを行うが（3）、シングルインサートの場合には同時反応もできる（4）。

Type IIS 制限酵素は、認識配列の下流を切断、切断部位は配列依存ではなく認識配列の距離に依存するため、自由に 4 塩基突出末端の配列をデザインできる。例えば、BsaI-HF v2 の認識配列は「GGTCTC (N1/N5)」　であるが、「GGTCTC」が認識配列（制限酵素が結合する領域）であり、その下流 1 塩基（トップ鎖）と 5 塩基（ボトム鎖）が切断部位である。この切断面の 4 塩基突出をアッセンブル付着面に利用する。また切断後の DNA 断片には BsaI-HF v2（Type IIS 制限酵素）の認識配列が残らないため、一旦アッセンブル（ライゲーション）された産物は切断されることは無く、正しいアッセンブル産物だけが得られる。

Golden Gate アッセンブリーは TALEs（5）や TALENs（6）などの複数の DNA 断片のアッセンブリーに良く用いられているが、一般的なシングルインサートのクローニングも可能である。またライブラリー作成や複数の部位特異的挿入にも用いることができる。

図1. Golden Gate アッセンブリーの原理（BsaI-HF v2 を使用）

図2. Golden Gate アッセンブリーのワークフロー

Golden Gate アッセンブリーでは、Type IIS 制限酵素を利用する。本キットでは BsaI-HF v2 を利用、その認識配列（GGTCTC）を 各 2 本鎖 DNA 断片の両末端に付加しておく。この際、切断配列はアッセンブルのために特異的配列をデザインしておく。切断後に生じた 4 塩基突出がアニールしてライゲーション、アッセンブルが完了する。

図3. ベクターマップ

pGGA ベクター。全長 2,714 bp。クローニングサイトには 2 箇所の BsaI サイトが存在する。