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NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit

NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kitカタログ番号:E7120

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E7120S 24 rxns ¥160,000 -20C/室温
E7120L 96 rxns ¥600,000 -20C/室温

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用(DNA, ChIP, mRNA, Small RNA)

特徴

バイサルファイト法に代わる新規メチル化 DNA シーケンス

2020 年 3 月:キット付属品およびマニュアルを変更

説明

全ゲノムバイサルファイトシーケンス(WGBS)はメチル化 DNA 解析における一般的方法ですが、バイサルファイト変換の際に DNA 損傷が起こりやすく、断片化や DNA のロス、不均一な GC カバレッジなどを生じることが問題となっています。

NEB のEM-seq では、酵素を使用したマイルドな条件下で非メチル化シトシンをウラシルに変換するため(図1)、DNA ダメージを低減することが可能です(図2)。さらにNEBNext Ultra II DNA キットとの組み合わせにより、高収量かつ低バイアスなメチル化 DNA シーケンス用ライブラリー調製ができ、5-mCと5-hmC の高感度検出を可能とします。

 

特長

• メチル化シーケンスのためのライブラリー調製キット

• 酵素でマイルドに変換、DNA ダメージを低減

• 10 ng DNA から高収量でライブラリー調製

• WGBS と同じ解析プログラムが使用可能

• WGBS より高感度、均一な GC カバレッジ

 テクニカルノート(英語、PDF ダウンロード)

Feature Article(英語)

     
  図1、酵素で非メチル化シトシンをウラシルに変換  
 

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WGBS と EM-seq は、どちらも非メチル化シトシンをウラシルに変換する。その PCR 産物は、ウラシルがチミンに置き換わるため、シーケンスでは非メチル化シトシンがチミン、メチル化シトシンはシトシンとして検出される。このことを利用してゲノムのメチル化シトシンを検出できる。

 

WGBS では 60-95 ℃ で化学的に、EM-seq では 37 ℃ で酵素を使用して変換を行う。EM-seq 法は 2 種類の酵素で非メチル化シトシンを脱アミノ化してウラシルに変換する。

1)TET2 がメチル化シトシン(mC と hmC)を特異的に酸化してカルボキシシトシン(5caC)に変換する

2)APOBEC が非メチル化シトシンをウラシルに変換する。この時、5caC と 5ghmC は変換されず、非メチル化シトシンだけがウラシルに変換される。

 
     

 

     
  図2、EM-seq は WGBS よりも高収量でライブラリー調製  
 

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EM-seq 法と従来の WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行ったところ、EM-seq は少ない PCR サイクル数で高収量のライブラリー調製ができることが示された。またこの結果から WGBS では調製中に DNA ロスが多いことが考えられる。サンプルはヒト NA 12878 ゲノム DNA(10、50、200 ng)、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。

 
     

 

     
  図3、EM-seq は 低いcoverage depthでWGBS よりも多くのCpGを検出  
 

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EM-seq 法とWGBS 法を用いて、異なる量のDNA からメチル化DNA 解析用ライブラリー調製を行った。サンプルはヒトNA12878 ゲノムDNA(10、50、200 ng)、Covaris® S2 で300 bp に断片化したものを用いた。WGBS はZymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナ NovaSeq 6000(2 × 100 bp)でシーケンス、hg38 でアライメントした(bwa-meth 0.2.2)。

 

(上段)各 coverage depth における CpG 検出数。EM-Seq と WGBS で調製したライブラリーのシーケンスリード(3.24 億ペアエンドリード)について、検出された CpG をカウントした。トップ鎖とボトム鎖の CpG は個別にカウントした結果、coverage depth = 1 のときに EM-seq で 5,600 万、WGBS で4,300 万の CpG サイトが検出された。coverage depth ごとの CpG サイトのプロットから、EM-Seq は低い coverage depth において、WGBS よりも多くの CpG を検出できることが示された。

 

(下段)3.24 億ペアエンドリードについて、EM-seq と WGBS のminimum coverage ごとの CpG サイト数を解析した。1x minimum coverage において、異なる 3 つのインプット量すべてで、EM-seq は WGBS よりも 20% 以上多い CpG が検出された。2 つの方法で検出された CpG 検出数の差は、8x を閾値として、minimumcoverage を上げると大きくなった。

 
     

 

     
  図4、EM-seq は WGBS よりも均一な GC coverage を示す  
 

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EM-seq 法と WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行い、ゲノムの各領域の GC 含量に対する coverage を解析した(Picard 2.17.2)。EM-Seq は広い GC 含量域で均一な coverage を示した。一方、WGBS は低 GC 含量領域の coverage が高く、高 GC 領域が低く示された。これはWGBS ライブラリーに一般的に見られる傾向である。

 

サンプルはヒト NA12878 ゲノム DNA(10、50、200 ng)、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナNovaSeq 6000(2 × 100 bp)でシーケンス、hg38 でアライメントした(bwa-meth 0.2.2)。

 
     

 

     
  図5、EM-seq は WGBS よりも大きなサイズのライブラリーを調製可能  
 

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EM-seq 法と WGBS 法を用いて調製したライブラリーをシーケンスしたところ、EM-seq のほうが大きいサイズのライブラリーを調製できることを示された(緑)。このことから EM-seq のほうが DNA ダメージが少ないことが示唆される。サンプルはヒト NA12878 ゲノム DNA(50 ng)、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナ MiSeq(2 × 76 bp)でシーケンス、Picard 2.18.14 でインサートサイズを求め、各インサートサイズのnormalized frequency をプロットした。

 
     

別途必要な試薬等

・DNA 断片化用機器(Covaris® S2 など) *NEBNext dsDNA Fragmentase は使用できません。

・Formamide (Sigma #F9037-100 ml) または 0.1 N NaOH

・80% エタノール など

キット内容

【ライブラリー調製試薬】 【変換試薬 *】
・NEBNext Ultra II End Prep Enzyme Mix ・TET2
・NEBNext Ultra II End Prep Reaction Buffer ・TET2 Reaction Buffer Supplement
・NEBNext Ultra II Ligation Master Mix ・Oxidation Enhancer

・NEBNext Ligation Enhancer

・Oxidation Supplement
・NEBNext Q5U Master Mix * ・Fe (II) Solution
・NEBNext Sample Purification Beads ・Stop Reagent
  ・APOBEC
【アダプターオリゴ*】 ・APOBEC Reaction Buffer
・NEBNext EM-seq Adaptor ・BSA
・EM-seq Index Primer 1-24 ・DTT ***
(E7120S、24 プレックス用ユニークインデックスペア **)  
・NEBNext 96 Unique Dual Index Primer Pairs Plate 【コントロール DNA】

(E7120L、96 プレックス用ユニークインデックスペア **)

・Control DNA CpG methylated pUC19
  ・Control DNA CpG unmethylated Lambda
   
* 別売あり(関連製品を参照)  
** インデックス配列は製品マニュアルの 18 ページ(S サイズ用)と 20 ページ(L サイズ用)に記載
*** 2020 年 3 月に新たに追加

メモ

2020 年 3 月:キットの構成品およびプロトコールの一部を変更


【変更内容】

・構成品:DTTを新たに追加

・マニュアルの変更(最新:Version 5.0)


【マニュアル変更箇所】

・TET2 反応に DTT を追加(6ページ、13ページ)