WGBS と EM-seq は、どちらも非メチル化シトシンをウラシルに変換する。その PCR 産物は、ウラシルがチミンに置き換わるため、シーケンスでは非メチル化シトシンがチミン、メチル化シトシンはシトシンとして検出される。このことを利用してゲノムのメチル化シトシンを検出できる。

WGBS では 60－95 ℃ で化学的に、EM-seq では 37 ℃ で酵素を使用して変換を行う。EM-seq 法は 2 種類の酵素で非メチル化シトシンを脱アミノ化してウラシルに変換する。

１）TET2 がメチル化シトシン（mC と hmC）を特異的に酸化してカルボキシシトシン（5caC）に変換する

２）APOBEC が非メチル化シトシンをウラシルに変換する。この時、5caC と 5ghmC は変換されず、非メチル化シトシンだけがウラシルに変換される。

EM-seq 法と従来の WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行ったところ、EM-seq は少ない PCR サイクル数で高収量のライブラリー調製ができることが示された。またこの結果から WGBS では調製中に DNA ロスが多いことが考えられる。サンプルはヒト NA 12878 ゲノム DNA（10、50、200 ng）、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。

EM-seq 法とWGBS 法を用いて、異なる量のDNA からメチル化DNA 解析用ライブラリー調製を行った。サンプルはヒトNA12878 ゲノムDNA（10、50、200 ng）、Covaris® S2 で300 bp に断片化したものを用いた。WGBS はZymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナ NovaSeq 6000（2 × 100 bp）でシーケンス、hg38 でアライメントした（bwa-meth 0.2.2）。

（上段）各 coverage depth における CpG 検出数。EM-Seq と WGBS で調製したライブラリーのシーケンスリード（3.24 億ペアエンドリード）について、検出された CpG をカウントした。トップ鎖とボトム鎖の CpG は個別にカウントした結果、coverage depth = 1 のときに EM-seq で 5,600 万、WGBS で4,300 万の CpG サイトが検出された。coverage depth ごとの CpG サイトのプロットから、EM-Seq は低い coverage depth において、WGBS よりも多くの CpG を検出できることが示された。

（下段）3.24 億ペアエンドリードについて、EM-seq と WGBS のminimum coverage ごとの CpG サイト数を解析した。1x minimum coverage において、異なる 3 つのインプット量すべてで、EM-seq は WGBS よりも 20% 以上多い CpG が検出された。2 つの方法で検出された CpG 検出数の差は、8x を閾値として、minimumcoverage を上げると大きくなった。

EM-seq 法と WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行い、ゲノムの各領域の GC 含量に対する coverage を解析した（Picard 2.17.2）。EM-Seq は広い GC 含量域で均一な coverage を示した。一方、WGBS は低 GC 含量領域の coverage が高く、高 GC 領域が低く示された。これはWGBS ライブラリーに一般的に見られる傾向である。

サンプルはヒト NA12878 ゲノム DNA（10、50、200 ng）、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナNovaSeq 6000（2 × 100 bp）でシーケンス、hg38 でアライメントした（bwa-meth 0.2.2）。

EM-seq 法と WGBS 法を用いて調製したライブラリーをシーケンスしたところ、EM-seq のほうが大きいサイズのライブラリーを調製できることを示された（緑）。このことから EM-seq のほうが DNA ダメージが少ないことが示唆される。サンプルはヒト NA12878 ゲノム DNA（50 ng）、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナ MiSeq（2 × 76 bp）でシーケンス、Picard 2.18.14 でインサートサイズを求め、各インサートサイズのnormalized frequency をプロットした。