EM-seq 法では 2 段階で変換を行う。

1) TET2 酵素が 5mC と 5hmC を酸化してそれぞれ 5caC と 5ghmC に変換する (図中、ca/g)。

2) APOBEC 酵素が非メチル化シトシンをウラシルに変換する。この時、5caC と 5ghmC は変換されず、非メチル化シトシンだけがウラシルに変換される。

変換した DNA を用いて、ウラシルが増幅できる Q5U DNA Polymerase で増幅すると、ウラシルがチミンに置き換わるため、シーケンスリードは非メチル化シトシン (ウラシル) がチミン、メチル化シトシン (5mC、5hmC) がシトシンとして検出される。この変換パターンはバイサルファイト法と同じであるため、EM-Seq と WGBS は同じプログラムを使用して解析できる。 

また EM-Seq の変換反応は 37℃ のマイルドなバッファー中で行うため、60－95 ℃ で化学的におこなうバイサルファイト法に比べて DNA のダメージが少なく、より微量な DNA 検体からの変換とライブラリー調製が可能となる。

EM-seq 法と従来の WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行ったところ、EM-seq は少ない PCR サイクル数で高収量のライブラリー調製ができることが示された。またこの結果から WGBS では調製中に DNA ロスが多いことが考えられる。サンプルはヒト NA 12878 ゲノム DNA（10、50、200 ng）、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。

EM-seq 法とWGBS 法を用いて、異なる量のDNA からメチル化DNA 解析用ライブラリー調製を行った。サンプルはヒトNA12878 ゲノムDNA（10、50、200 ng）、Covaris® S2 で300 bp に断片化したものを用いた。WGBS はZymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナ NovaSeq 6000（2 × 100 bp）でシーケンス、hg38 でアライメントした（bwa-meth 0.2.2）。

（上段）各 coverage depth における CpG 検出数。EM-Seq と WGBS で調製したライブラリーのシーケンスリード（3.24 億ペアエンドリード）について、検出された CpG をカウントした。トップ鎖とボトム鎖の CpG は個別にカウントした結果、coverage depth = 1 のときに EM-seq で 5,600 万、WGBS で4,300 万の CpG サイトが検出された。coverage depth ごとの CpG サイトのプロットから、EM-Seq は低い coverage depth において、WGBS よりも多くの CpG を検出できることが示された。

（下段）3.24 億ペアエンドリードについて、EM-seq と WGBS のminimum coverage ごとの CpG サイト数を解析した。1x minimum coverage において、異なる 3 つのインプット量すべてで、EM-seq は WGBS よりも 20% 以上多い CpG が検出された。2 つの方法で検出された CpG 検出数の差は、8x を閾値として、minimumcoverage を上げると大きくなった。

EM-seq 法と WGBS 法を用いて、異なる量の DNA からメチル化 DNA 解析用ライブラリー調製を行い、ゲノムの各領域の GC 含量に対する coverage を解析した（Picard 2.17.2）。EM-Seq は広い GC 含量域で均一な coverage を示した。一方、WGBS は低 GC 含量領域の coverage が高く、高 GC 領域が低く示された。これはWGBS ライブラリーに一般的に見られる傾向である。

サンプルはヒト NA12878 ゲノム DNA（10、50、200 ng）、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナNovaSeq 6000（2 × 100 bp）でシーケンス、hg38 でアライメントした（bwa-meth 0.2.2）。

EM-seq 法と WGBS 法を用いて調製したライブラリーをシーケンスしたところ、EM-seq のほうが大きいサイズのライブラリーを調製できることを示された（緑）。このことから EM-seq のほうが DNA ダメージが少ないことが示唆される。サンプルはヒト NA12878 ゲノム DNA（50 ng）、Covaris® S2 で 300 bp に断片化したものを用いた。WGBS は Zymo Research EZ DNA Methylation-Gold™ Kit と NEBNext Ultra II DNA kit を併用した。イルミナ MiSeq（2 × 76 bp）でシーケンス、Picard 2.18.14 でインサートサイズを求め、各インサートサイズのnormalized frequency をプロットした。