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Monarch Genomic DNA Purification Kit

Monarch Genomic DNA Purification Kitカタログ番号:T3010

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

T3010S 50 Preps ¥20,000 室温
T3010L 150 Preps ¥52,000 室温

製品カテゴリ>グループ

  • 核酸精製キット>ゲノムDNA精製

特徴

幅広いサンプルから高収量でゲノムDNAを精製

 

特長:   
・ 幅広いサンプルに対応 ・ 残存 RNA が最小限の DNA 精製 (<1%)
・ 精製 DNA のピークサイズは >50 kb ・ 抽出済みの DNA のクリーンアップも可能
・ 難しいサンプルでも高収量 ・ NGS ライブラリー調製、PCR、qPCR などに最適

 

 Monarch ゲノム DNA 精製キットのワークフロー

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 Monarch ゲノム DNA 精製キットの特性:

 サンプル  培養細胞(哺乳細胞): up to 5 x 106 cells
 全血(哺乳類): 100 µl
 組織: up to 25 mg(組織の種類によって異なる)
 バクテリア: up to 2 x 109
 酵母: up to 5 x 107

 唾液: up to 500 µl

 口内スワブ
 抽出済み DNA
 カラム結合能  30 µg genomic DNA
 収量  サンプルの種類によって異なる
 ゲノムサイズ  ピークサイズは > 50 kb(唾液と口内スワブから精製した DNA はやや小さくなる)
 RNA 残存率  < 1% (with included RNase A treatment)
 溶出液量  ≥35 µl( 100 µl を推奨)
 純度  A260/280 ≥ 1.8
 A260/230 ≥ 2.0

 

検証済みサンプル:

 Mouse Ear(マウス、耳)  Rat Muscle(ラット、筋肉)  HeLa Cells(HeLa 細胞)
 Mouse Liver(マウス、肝臓)

 Deer Muscle(シカ、筋肉)

 HEK293 Cells(HEK293 細胞)
 Rat Liver(ラット、肝臓)  Human Blood(ヒト、血液)  NIH3T3 Cells(NIH3T3 細胞)
 Mouse Kidney(マウス、腎臓)  Mouse Blood(マウス、血液)  E. coli(大腸菌)
 Mouse Spleen(マウス、脾臓)  Rabbit Blood(ウサギ、血液)  Rhodobacter sp.(紅色細菌)
 Mouse Heart(マウス、心臓)  Pig Blood(ブタ、血液)  B. cereus(セレウス菌)
 Mouse Lung(マウス、肺)  Guinea Pig Blood(モルモット、血液)  T. kodakarensis(好熱性アーキア)
 Mouse Brain(マウス、脳)  Cow Blood(ウシ、血液)  S. cerevisiae(酵母)
 Rat Brain(ラット、脳)  Horse Blood(ウマ、血液)  Saliva(唾液)
 Dog Blood(イヌ、血液)  Buccal swab(口内スワブ)

 

 図1、幅広いサンプルで、他社キットより高収量かつ長い DNA の精製が可能
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Agilent Technologies® 4200 TapeStation® Genomic DNA ScreenTape により、各サンプルから Monarch Genomic DNA Purifcation Kit と Q 社キットを使って精製した gDNA を測定した。溶出は 100 μl で行い、1/100 希釈した精製 DNA を測定に用いた。Monarch で精製した DNA のピークサイズは 50–70 kb で、DIN = 9 前後であったが、Q 社キットでの精製 DNA はおよそ < 30 kb、DIN = 7–8 であった。また、Q 社キットでは凍結血液サンプル、肝臓、脳、筋肉において収量と A260/230 が低かった。

他のサンプルおよび収量などの詳細

 

 

 

 図2、精製の難しいサンプルにおいても高い収量

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  RNAlater® を使って保存されたラット組織 10 mg から各社キットを使い、各社推奨プロトコールに従い、n = 2 で破砕と精製を行った。オプションの RNAase A 処理も含まれる。溶出は各キット付属のバッファー 100 μl 行い、LC-MS により測定したRNA を除いた DNA を比較した (n = 2)。Monarch Genomic DNA Purifcation Kit は、このような難しいサンプル (脂肪が多い、繊維質など) を含む幅広い組織において、より高収量な精製が可能なことが示された。  

 

 

 図3、精製の難しいサンプルにおいても高い収量

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  モナークと各社ゲノム精製キットを用いて様々なサンプルから DNA を精製して、残存 RNA 量を測定した結果、すべてのサンプルでモナークの残存 RNA が低いことが示された(表中、緑)。ヒト全血 100 µl、HeLa 細胞 1 x 106 個、RNAlater に保存したマウステール、ラット組織(肝臓、脳、筋肉)を各 10 mg ずつを用い、各社推奨条件に従って DNA を精製、100 µl で溶出した(n=2)。精製 DNA の 1 µg を Nucleoside Digestion Mix(NEB #M0649)で処理して LC-MS で測定した。。  

 

 

 図4、モナークで精製した DNA はロング PCR や qPCR に使用可能

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A. HeLa 細胞およびヒト血液からモナークで精製した DNA を用いてサイズの異なる各領域を PCR で増幅した。市販のヒト細胞株 NA19240 F11 由来のリファレンス DNA と比較したところ、特に 20 kb の領域の増幅に違いが見られたことから、モナークはゲノム DNA をインタクトな状態で精製できること、またロング PCR に適してることを示された。PCR は 25 ng の DNA を用いて、LongAmp Hot Start Taq 2X Master Mix(NEB #M0533)により、ヒト DNA の各領域(6、8、10、12、16、20 kb)に特異的なプライマーペアを用いて実施した(Applied Biosystems® 2720 thermalcycler1)。PCR 産物と分子量マーカー:1 kb DNA Ladder(NEB #N3232)を 1.5% アガローズゲルに供した。

 

B. ヒト全血、HeLa 細胞、マウステールからモナークで精製した DNA を用いて qPCR を行った。すべてのサンプルと希釈系列において良好な増幅曲線が得られたことから、阻害剤が含まれない高純度なゲノム DNA が精製されていることが示された。Luna Universal qPCR Master Mix(NEB #M3003)を使用し、gHEME(ヒト全血)および gREL(HeLa 細胞、マウステール)のそれぞれに対するプライマーで qPCR を行った(Bio-Rad® CFX Touch qPCR thermalcycler)。精製 DNA は 5 つのログレンジになるように希釈して使用した。

 

 

 

 図5、NGS ライブラリー調製のインプット DNA に最適
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A. モナーク(オレンジ)および他社同等品により HeLa 細胞 100 ng からゲノム DNA を精製、、NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit(NEB #E7805)でライブラリー調製を行った(n=2)。リードは Bowtie 2.2.4 を使用してマッピング、GC coverage は Picard’s CollectGCBiasMetrics(v1.117)を使用して算出した。Normalized coverage(1.0)をグレーの水平線、各 GC % での 100 bp 領域数をグレーの垂直バーで示した。また、色付けした線は各ライブラリーの normalized coverage を表している。

 

B. 各社キットで精製したゲノム DNA からのライブラリー収量を確認した結果、モナークで精製した DNA で高収量のライブラリーが調製できることが示された。ライブラリー収量収率は High Sensitivity DNA Kit を使用してAgilent 2100A Bioanalyzer(Agilent Technologies®)で評価した。

 

 

 

 図6、長い DNA を精製できるため、Nanopore シーケンスに最適

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モナークおよび他社同等品により HeLa 細胞からゲノム DNA を精製した。精製 DNA の 1 µg を使用して、DNA を断片化せずに ONT 1D Ligation Sequencing Kit(SQK-LSK109)のプロトコールに従って、オックスフォード・ナノポアテクノロジーズ(ONT)用シーケンスライブラリーを調製した。GridION(Flow cell R9.4.1)で48 時間データ測定した。一般的なシーケンシング指標である A)シーケンスデータ総量、および B)リード長において、モナークで精製したゲノム DNA は、他社同等品で精製した DNA よりも高い数値を示した。NanoComp(Bioinformatics, Volume 34, Issue 15, 1 August 2018, Pages 2666–2669)を使用して解析した。

 

 

ガイドライン & FAQ

ゲノム DNA 精製に使用するサンプル量(英語)

血液あるいは組織からのゲノム DNA 精製における精製度向上のヒント(英語)

組織のサンプリングのヒント(英語)

トラブルシューティング(英語)

FAQ(よくある質問、英語)

 

・動画    
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Monarch ゲノム精製キットの使い方(英語)   ゲノム精製に使用する組織サンプルの調製および保存のヒント(英語)

メモ

2019年7月18日:プロトコールの一部を変更

 

【変更箇所】

カラムに結合したゲノムDNAの洗浄工程


【変更内容】

・変更前:Wash Bufferを添加後、ふたを閉めてカラムを数回転倒混和、もしくはボルテックスで攪拌する

・変更後:Wash Bufferを添加後、ふたを閉めてカラムを数回転倒混和

 

【備考】

マニュアルは変更済み