Hi-T4 DNA Ligase
カタログ番号 |
サイズ |
濃度 |
価格 |
保存温度 |
|---|---|---|---|---|
| M2622S | 20,000 units | 400,000 cohesive end units/ml | ¥11,600 | -20C |
| M2622L | 100,000 units | 400,000 cohesive end units/ml | ¥46,300 | -20C |
製品カテゴリ>グループ
- ＤＮＡ修飾酵素&クローニング>リガーゼ＆ライゲーションキット
特徴
・耐熱性が高い Hi-T4 DNA Ligase
・25 - 50 ℃ での高温反応が可能
・最大 72 時間、45 ℃ でのインキュベーションでもほぼ失活しない
・高温 / 低温の温度サイクルが必要な実験にも使用可能
説明：
T4 DNA Ligase のバリアントで耐熱性を有する DNA リガーゼである。一般的な T4 DNA Ligase と同様、2 本鎖 DNA および 2 本鎖 RNA の 5' リン酸と3' OH 末端を結合する。突出/平滑末端のライゲーションに加えて、2 本鎖 DNA と 2 本鎖 RNA、DNA/RNA ハイブリッド中のニックも修復できる。 最高 50 ℃でライゲーション反応が可能である。
Figure 1: Hi-T4 DNA Ligase displays increased thermotolerance compared to T4 DNA Ligase.
400 units of T4 DNA Ligase (NEB #M0202) or Hi-T4 DNA Ligase (NEB #M2622) were pre-incubated at 45°C in 1X T4 DNA Ligase Buffer in the absence of DNA substrate for the indicated time. Residual ligase activity was tested by adding 0.12 μM HindIII (cohesive end) fluorescently-labeled fragments and incubating at 37°C for 15 minutes. Ligation products were detected by capillary electrophoresis.
T4 DNA Ligase steadily loses activity at 45°C, whereas Hi-T4 DNA Ligase retains full activity on a cohesive end substrate, even after 72 hours at 45°C.
Figure 2: Hi-T4 DNA Ligase withstands higher temperature cycling than T4 DNA Ligase.
1,000 units of T4 DNA Ligase (NEB #M0202) or Hi-T4 DNA Ligase (NEB #M2622) in (1X) T4 DNA Ligase Buffer were cycled in the presence of DNA at 42°C (A) or 50°C (B) for 5 minutes followed by 16°C for 5 minutes in the presence of 1 μg pBR322. Following the indicated number of cycles (0, 15, 30, 45 or 60), ligase activity was tested on a fluorescently-labeled, cohesive-end substrate (HindIII overhang, 25°C for 10 minutes). Ligation products were detected by capillary electrophoresis. Remaining ligase activity (relative to 0 cycle data point) is shown.
A. T4 DNA Ligase gradually loses activity after cycling between 16°C and 42°C (gold line, A), while Hi-T4 DNA Ligase maintains activity after 60 cycles between 16°C and 42°C (orange line, A).
B. T4 DNA Ligase is completely inactivated after only 15 cycles between 16°C and 50°C (gold line, B), while Hi-T4 DNA Ligase maintains ~60% activity after 60 cycles between 16°C and 50°C (orange line, B).
付属試薬：
・T4 DNA Ligase Reaction Buffer
・StickTogether™ DNA Ligase Buffer
プロトコール
酵素特性
ユニット定義：
1 ユニットは、20 ul の反応溶液中、25 ℃、30 分間で 6 ug の Lambda-HindIII DNA の 50 % をライゲーションするために必要な酵素量として定義
反応条件：
1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer
25 ℃ でインキュベーション
T4 DNA Ligase Reaction Buffer 組成（1x）
・50 mM Tris-HCl
・10 mM MgCl2
・1 mM ATP
・10 mM DTT
(pH 7.5 @ 25°C)
保存温度：
-20°C
酵素溶液組成：
・10 mM Tris-HCl
・50 mM KCL
・1 mM DTT
・0.1 mM EDTA
・50% Glycerol
pH 7.4 @ 25°C
熱による不活性化：
65°C for 10 min
メモ
１．ATP is an essential cofactor for the reaction. This contrasts with E. coli DNA ligase which requires NAD.
２．To dilute Hi-T4 DNA Ligase that will subsequently be stored at -20°C, 50% glycerol storage buffer (Diluent Buffer A, NEB #B8001S) should be used; to dilute for immediate use, 1X T4 DNA Ligase Reaction Buffer can be used.
３．Ligation Temperature
For cohesive (sticky) ends (1X T4 DNA Ligase Buffer), incubate 1 µl of Hi-T4 DNA Ligase in a 20 µl reaction between 25-50ºC for 10 minutes. For blunt ends or single base overhangs (1X StickTogether DNA Ligase Buffer), incubate 1 µl of Hi-T4 DNA Ligase in a 20 µl reaction between 25-50ºC for 10 minutes. Do not heat kill the reaction because heat treating the PEG in the StickTogether DNA Ligase Buffer will inhibit transformation.
参考文献
Engler, M.J. and Richardson, C.C. (1982). P.D. Boyer(Ed.), 5, San Diego: Academic Press.
