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Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit

Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kitカタログ番号:E3030

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E3030S 100 rxns ¥122,500 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • リアルタイム PCR>1-ステップ RT-qPCR (ダイ)

備考

  • 備考:ライセート調製 100 回分 ( 50 μl反応 ) 、1ステップRT-qPCR 500 回分 ( 20 μl )

特徴

RNA 精製不要な細胞ライセートからのダイレクトなリアルタイム PCR試薬

 

培養細胞は、生体の代わりとして、遺伝子発現や治療反応の解析にしばしば使われます。通常の解析に使われる RNA はスピンカラムや試薬を使った方法で精製されます。Luna Cell Ready Lysis Module を使うことで、このRNA精製ステップを省くことが可能となります。Luna Cell Ready Lysis Module には、Luna Cell Ready ProteinaseとDNaseが含まれ、ゲノムDNAが除去済みの細胞ライセートがわずか15分で完成します。ライセートは、Luna 1ステップRT-qPCR Kitsとの組み合わせで最適なパフォーマンスが得られます。

 

特長

・細胞溶解 100 回分(50 μl反応)および 1 ステップ RT-qPCR 反応 500 回分(20 μl 反応)が同梱

・10 – 100,000 細胞に使用可

・ダイ・アッセイ用試薬*(プローブ・アッセイ用試薬はこちら

・ライセート調製(細胞溶解、RNA リリース、ゲノムDNA 除去)はわずか 15 分

・熱安定性 Luna WarmStart 逆転写酵素と Hot Start Taq で室温でのセットアップが可能

・独自の Luna Cell Ready RNA Protection Reagent が含まれ、細胞溶解中も RNA を保護

・溶解バッファーには、トラッキングダイ**が含まれ、ワークフローを視覚的に補助

・細胞ライセート調製用モジュールのみの購入が可能モジュールはこちら

 

*SYBR Green と同等のダイ (色素)が使用されており、SYBR/FAM フィルターで検出できます。

**青色トラッキング・ダイは qPCR 反応やシグナルに影響を及ぼすことはありません。

 

Table 1: 検証済み細胞種

Cell line 性質 由来 細胞数 / 50 μl ライセート
A549 付着細胞 ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞 10 - 100,000
HEK293 付着細胞 ヒト胎児腎細胞293 10 - 100,000
HeLa 付着細胞 ヒト子宮頸癌 10 - 100,000
HepG2 付着細胞 ヒト肝癌由来細胞 10 - 1,000
NCI-H460 付着細胞 ヒト胚がん 10 - 100,000
SK-N-SH 付着細胞 ヒト神経芽細胞腫 10 - 10,000
U2Os 付着細胞 ヒト骨肉腫 10 - 100,000
Jurkat 浮遊細胞 ヒトT細胞性白血病 10 - 100,000
K-562 浮遊細胞 ヒト慢性骨髄性白血病 10 - 100,000

 

 

Figure 1: Luna Cell Ready One-Step RT-qPCRワークフロ―

 

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Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR は培養細胞からのRNA 検出および定量のために必要なすべてのコンポーネントを含んでいる(最大100,000 細胞/50 μl)。DNase IとLuna Cell Ready Protease が含まれており、シンプルなワークフローにより15 分で細胞溶解、RNA リリース、ゲノムDNA 除去を同時に行う。RT-qPCR へは最大2 μlのライセート(0.2–4,000 細胞からのRNA 相当)を用いる。

 

 

Figure 2: The Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit offers sensitive and accurate quantitation of RNA directly from cell lysates across 5-log cell inputs

 

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Serial dilutions of HeLa cells (100,000 – 10) were lysed in 50 μl Luna Cell Ready lysis reactions (NEB #E3032) using standard reaction conditions (10 min lysis at 37°C, 5 min inactivation at 25°C). Genes of interest (GOI) were then quantitated using the Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3005) using 1 μl of cell lysate as input (equal to 0.2 – 2,000 cells in a 20 μl RT-qPCR reaction), with duplicate reactions at each input concentration. Results for β-actin, an abundant target (A) and SMG1, a less abundant target (B) are shown. Efficiency (E) and linearity (R2) are shown in right panels.

 

 

Figure 3: The Luna Cell Ready One-Step RTLuna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit は細胞ライセートからダイレクトにRNA 定量が可能、精製済みRNA と同等の正確で信頼性の高い結果

 

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Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit は精製済みRNA と同等の正確で信頼性の高い結果が得られた。Luna Cell Ready lysis reactions(NEB#E3032)50 μl で調製したA549 細胞ライセートと、A549 細胞からカラムで精製したRNA を用いて、3 種類のターゲットのRT-qPCR を行ったところ、すべて同等の定量結果が得られた。ライセートはA549 細胞をLuna Cell Ready Lysis module(NEB #E3032)を使用して、10–100,000 細胞にシリアル希釈し、50 ul の系で調製した。

A. 1 ul のライセート(0.2–2,000 細胞に相当)と、カラム精製したRNAをテンプレートとして、Luna Universal One-Step RT-qPCR kits(NEB#3005)で20 ul の系でRT-qPCR を実施した。ターゲットは高発現のβ -actin、低発現のARF3 とtublin の3 種類を使用した。ライセートとカラム精製RNA の両方において、0.2–2,000 細胞の5 段階の希釈系列すべてにおいて、高い直線性と増幅性が認められた。(E:増幅効率)
B. 高発現ターゲット:β -actin の各Cq をベースラインとして、低発現ターゲットのARF3 とtublin のΔCq をプロットした。各ターゲットの平均ΔCq はライセートとカラム精製RNA でほぼ同等であったことから、Luna Cell Ready は精製済みRNA と同等の、正確で信頼性の高い結果をもたらすことが示された。

 

Figure 4: The Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR kit outperforms commercially available cell lysis One-Step RT-qPCR kits with respect to both efficiency and sensitivity.

 

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Serial dilutions of A549 cells (100,000 - 10) were lysed in 50 µl Luna Cell Ready lysis reactions (NEB #E3032) using standard reaction conditions. Alternatively, the same amount of cells were lysed with commercially available kits from Company B, Company Q and Comapany T following manufacturer-recommended protocols. Genes of interest were then quantitated using the One-Step RT-qPCR module from each kit with 1 μl of cell lysate as input (equal to 0.2 -2,000 cells in a 20 µl RT-qPCR reaction), with duplicate reactions at each input concentration. Amplification of β-actin, an abundant target, and RPL32 and Tubulin, two less abundant targets, across 5-logs of cell inputs are shown for all kits. To standardize results, 12% of total fluorescence was set as a threshold. Efficiency (E) and the Cq of the highest and lowest input are shown.

 

 

Figure 5: Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit は最も立ち上がりが早く良好なパフォーマンス

 

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発現量の異なる各遺伝子において、Luna Cell Ready One-Step RTqPCRKit と各社同等品のCq 値を比較したところ、Luna Cell Ready では発現量に関係なく立ち上がりが早かった。
約2,500 個のA549 細胞をLuna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit および各社同等品でそれぞれのプロトコールにしがって細胞ライセートを調製した(バイオロジカルリプリケートN=2)。各ライセートの1 μlをそれぞれ推奨の1 ステップRT-qPCR 試薬でターゲットの検出を行い、総蛍光量の12% をThreshold としてCq 値とし、各社ごとの平均Cq 値をドットプロットした。
Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR Kit と各社試薬との平均ΔCq 値は、B 社2.3、Q 社3.8、T 社3.6 であった。

 

 

付属試薬:

・Luna Cell Ready Lysis Buffer

・Luna Cell Ready RNA Protection Reagent

・Luna Cell Ready Protease

・Luna Cell Ready Stop Solution

・DNase I (RNase-free)

・Luna WarmStart RT Enzyme Mix

・Luna Universal One-Step Reaction Mix

・Nuclease-free Water

別途必要な試薬等

・Phosphate-buffered saline (PBS)(細胞洗浄用)

・ターゲット検出用プライマー

・フィルターチップ*などのプラスチック消耗品

など

 

*クロスコンタミネーションのリスクを最小限にするため、フィルターチップのご使用を強くお勧めします。