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Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit

Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kitカタログ番号:E3031

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E3031S 100 rxns ¥116,400 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • リアルタイム PCR>1-ステップ RT-qPCR (プローブ)

備考

  • 備考:ライセート調製 100 回分 ( 50 μl反応 ) 、1ステップRT-qPCR 500 回分 ( 20 μl )

特徴

RNA 精製不要な細胞ライセートからのダイレクトなリアルタイム PCR試薬

 

培養細胞は、生体の代わりとして、遺伝子発現や治療反応の解析にしばしば使われます。通常の解析に使われる RNA はスピンカラムや試薬を使った方法で精製されます。Luna Cell Ready Lysis Module を使うことで、このRNA精製ステップを省くことが可能となります。Luna Cell Ready Lysis Module には、Luna Cell Ready ProteinaseとDNaseが含まれ、ゲノムDNAが除去済みの細胞ライセートがわずか15分で完成します。ライセートは、Luna 1ステップRT-qPCR Kitsとの組み合わせで最適なパフォーマンスが得られます。

 

特長

・細胞溶解 100 回分(50 μl反応)および 1 ステップ RT-qPCR 反応 500 回分(20 μl 反応)

・10 – 100,000 細胞に使用可

・プローブ・アッセイ用試薬が同梱(ダイ・アッセイ用試薬はこちら

・ライセート調製(細胞溶解、RNA リリース、ゲノムDNA 除去)はわずか 15 分

・熱安定性 Luna WarmStart 逆転写酵素と Hot Start Taq で室温でのセットアップが可能

・独自の Luna Cell Ready RNA Protection Reagent が含まれ、細胞溶解中も RNA を保護

・溶解バッファーには、トラッキングダイ**が含まれ、ワークフローを視覚的に補助

・細胞ライセート調製用モジュールのみの購入が可能モジュールはこちら

 

*青色トラッキング・ダイは qPCR 反応やシグナルに影響を及ぼすことはありません。

 

Table 1: 検証済み細胞種

Cell line 性質 由来 細胞数 / 50 μl ライセート
A549 付着細胞 ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞 10 - 100,000
HEK293 付着細胞 ヒト胎児腎細胞293 10 - 100,000
HeLa 付着細胞 ヒト子宮頸癌 10 - 100,000
HepG2 付着細胞 ヒト肝癌由来細胞 10 - 1,000
NCI-H460 付着細胞 ヒト胚がん 10 - 100,000
SK-N-SH 付着細胞 ヒト神経芽細胞腫 10 - 10,000
U2Os 付着細胞 ヒト骨肉腫 10 - 100,000
Jurkat 浮遊細胞 ヒトT細胞性白血病 10 - 100,000
K-562 浮遊細胞 ヒト慢性骨髄性白血病 10 - 100,000

 

 

Figure 1: Luna Cell Ready One-Step RT-qPCRワークフロ―

 

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Luna Cell Ready One-Step RT-qPCR は培養細胞からのRNA 検出および定量のために必要なすべてのコンポーネントを含んでいる(最大100,000 細胞/50 μl)。DNase IとLuna Cell Ready Protease が含まれており、シンプルなワークフローにより15 分で細胞溶解、RNA リリース、ゲノムDNA 除去を同時に行う。RT-qPCR へは最大2 μlのライセート(0.2–4,000 細胞からのRNA 相当)を用いる。

 

 

Figure 2: Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit は、細胞ライセートからダイレクトにマルチプレックスRNA 定量が可能

 

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10–100,000 細胞のHele 細胞から、Luna Cell Ready でライセートを調製、Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit で3 種類のターゲットを同時に検出したところ、個別検出と同等の定量結果が得られた。50 ul のライセート(37℃ 10 分で溶解、25℃ 5 分で不活性化でライセートを調製)から1 ul を使用して、20 ul の系でRT-qPCR をおこなった(0.2–2,000 細胞に相当)。ターゲットは高発現のβ -actin(Texas Red)とGAPDH(FAM)、低発現のRPL32(HEX)の3 種類を使用した(N=2)。

A. マルチプレックスRT-qPCR の増幅曲線とスタンダードカーブ

B. シングルプレックスRT-qPCR の増幅曲線

C. マルチ/ シングルプレックスの各ターゲットのCq の比較

 

 

Figure 3: The Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit offers reliable and precise RNA quantitation comparable to purified RNA across 5-log cell inputs.

 

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Serial dilutions of A549 cells (100,000 - 10) were lysed in 50 µl Luna Cell Ready lysis reactions (NEB #E3032) using standard reaction conditions (10 min lysis at 37°C, 5 min inactivation at 25°C). Alternatively, RNA was purified using a column-based RNA extraction kit. A. Genes of interest were then quantitated using the Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (NEB #E3006) with 1 μl of cell lysate (closed circles, left) or purified RNA (open circles, right) as input (equal to 0.2 – 2,000 cells in a 20 µl RT-qPCR reaction), with duplicate reactions at each input concentration. Detection of β-actin, an abundant target, and ARF3 and Tubulin, two less abundant targets, is shown across 5-logs of cell inputs. Efficiency (E) for each target is shown at the lower left corners of each panel.

 

 

Figure 4: The Luna Cell Ready Probe One-Step RT-qPCR Kit outperforms commercially available cell lysis One-Step RT-qPCR kits with respect to both efficiency and sensitivity.

 

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Serial dilutions of A549 cells (100,000 - 10) were lysed in 50 µl Luna Cell Ready lysis reactions (NEB #E3032) using standard reaction conditions. Alternatively, the same amount of cells were lysed with commercially available kits from Bio-Rad (SingleShot™ Probes One-Step Kit for Cell Lysis and RT-qPCR, #172-5070), Qiagen (FastLane Cell Probe Kit, #216413) and Thermo Fisher (Cells-to-CT 1-Step TaqMan Kit, A25603) following manufacturer-recommended protocols. Genes of interest were then quantitated using the One-Step RT-qPCR module from each kit with 1 μl of cell lysate as input (equal to 0.2 -2,000 cells in a 20 µl RT-qPCR reaction), with duplicate reactions at each input concentration. Amplification of β-actin (Tye), GAPDH (FAM), and RPL32 (Cy5) in multiplex assays across 5-logs of cell inputs are shown for all kits. To standardize results, approximately 10% (Tye), 5% (FAM), 15% (Cy5) total fluorescence was set as a threshold for each kit. Efficiency (E) and the Cq of the highest and lowest input are shown.

 

 

付属試薬:

・Luna Cell Ready Lysis Buffer

・Luna Cell Ready RNA Protection Reagent

・Luna Cell Ready Protease

・Luna Cell Ready Stop Solution

・DNase I (RNase-free)

・Luna WarmStart RT Enzyme Mix

・Luna Universal Probe One-Step Reaction Mix

・Nuclease-free Water

別途必要な試薬等

・Phosphate-buffered saline (PBS)(細胞洗浄用)

・ターゲット検出用プライマー

・フィルターチップ*などのプラスチック消耗品

など

 

*クロスコンタミネーションのリスクを最小限にするため、フィルターチップのご使用を強くお勧めします。