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NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 4)

NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 4)カタログ番号:E6446

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E6446S 96 rxns ¥78,700 ¥70,830 -20C
E6446L 384 rxns ¥282,200 ¥253,980 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用アダプターオリゴ

備考

  • 備考:2022年サマーキャンペーン(2022年7月12日~8月19日)

特徴

Illumina用 アダプターオリゴ


特長:

・ループ状アダプターとユニーク・デュアル・インデックス・プライマーが付属

・最大 96 プレックス解析

E6440E6442E6444 と併用すれば最大 384 プレックス解析が可能

・ユニークなインデックス・プライマーペアにより、インデックス・ホッピングを低減

・96 ウェルプレートで提供、1 ウェルに i5 と i7 インデックス・プライマーがプレミックス済み

 

Figure 1. アダプターオリゴの付加手順
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NEBのアダプターオリゴは1本鎖DNAがループを形成した構造をとっており、頂点部にウラシル残基を保有します。アダプターライゲーション後にUSER Enzymeを加えて15分間処理することにより、ウラシルが切断されてPCRで増幅可能な断片となります。インデックスやP5、P7配列はPCR反応の際に付加されます。PCRフリーのアプリケーションには対応していません。

 

 

Figure 2: ループ状アダプターによりライブラリー収量を向上、かつアダプターダイマーを低減
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NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs) と IDT® for Illumina® –TruSeq® DNA UD Indexes (Illumina # 20022370) を用いてライブラリー調製を行ったところ、NEBNext ループ状アダプターを用いた方がライブラリー収量が高く、アダプターダイマーが少ないことを示された。100 ng の ヒト NA 19240 ゲノム DNA (Coriell Institute) を使用、NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (#E7805) で 8 個ずつ、計 16 個のライブラリー調製を行った。調製最後の PCR を 4 サイクルで実施、クリーンアップした後に Agilent® TapeStation® 4000 で測定した。


A) 平均ライブラリー収量。IDT 社の Y 字状アダプターよりも NEBNext ループ状アダプターを使用したほうが約 60 % ライブラリー収量が高かった。


B) 16 個のライブラリーの TapeStation 解析結果。オレンジ色の矢印で示したバンドがアダプターダイマーを示す。IDT 社の Y 字状アダプターを使用した場合にはアダプターダイマーの発生が観察されたが、NEBNext ループ状アダプターでは一切観察されなかった。

 

 

Figure 3: 96 種類のプライマーペアは偏りなくライブラリーを調製

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キット内の 96 種類すべてのプライマーペアを使用して、同じゲノム DNA サンプルから NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (#E7805) でライブラリー調製、それらを等モルでプールして Illumina MiSeq あるいは NovaSeq 6000 でシーケンスした (2 x 150 bp)。総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 1.04 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。このことは、プライマーペアによる増幅の偏りがないことを示す。

 

 

Figure 4: 96 種類のプライマーペアはサンプルによらず均一にライブラリーを調製
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ヒト NA19240 ゲノム DNA (Coriell Institute) をインプットとして (RNA はヒト・リファレンス・トータル RNA)、NEBNext 96 Unique Dual Index Primer Pairs を使用して、以下の異なる 5 種類の方法でライブラリー調製とシーケンスを行った。5 種類の方法は以下のとおりである。


 ・NEBNext Ultra II FS DNA library prep kit (酵素的断片化、ゲノム解析)

 ・Covaris-sheared DNA with the NEBNext Ultra II DNA library prep kit (物理的断片化、ゲノム解析)

 ・NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit (物理的断片化、酵素変換、全ゲノムメチル化解析)

 ・Ultra II DNA library prep kit combined with bisulfite conversion (物理的断片化、バイサルファイト変換、全ゲノムメチル化解析)

 ・NEBNext Ultra II Directional RNA library prep kit (トランスクリプトーム解析)


それぞれ 96 種類のインデックスペアを用いてライブラリー調製 (n=2)、Agilent® TapeStation® 4200でライブラリー QC を実施、等モルでプールしてシーケンス、総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 1.04 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。このことは、どのようなライブラリー調製においても均一にライブラリーを調製できること、プライマーペアによる増幅の偏りがないことを示す。

 

 

Figure 5: ユニーク・デュアル・インデックスはインデックス・ホッピングで生じたリードを検出・除外可能

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NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit (NEB #E7645) と NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (96 Unique Dual Index Primer Pairs Set 1-4) を使用して、同一のゲノムインプットから 384 種類のライブラリーを調製、等モルでプールして Illumina NovaSeq® 6000 でシーケンス、総リード数に対する各ライブラリーのリード数を算出した (理論値は 0.26 %)。結果、いずれのライブラリーでも偏りがなく、理論値に近いリード数が得られた。 

アダプターオリゴと併用可能なライブラリー調製試薬

NEBNext Ultra II DNA

NEBNext Ultra II (Directional) RNA

キット内容

・NEBNext Adaptor for Illumina

・USER Enzyme

・10 µM each NEBNext 96 Unique Dual Index Primer Pairs Plate (Set 4) *1 *2

 

*1. 96 穴プレートとして提供、各ウェルにユニークなプライマーペア(プレミックス)が含まれています。

*2. インデックス配列はマニュアルもしくはサンプルシートをご覧ください。