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Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit

Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kitカタログ番号:E3019

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E3019S 96 rxns ¥54,000 -20C
E3019L 480 rnxs ¥240,000 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • リアルタイム PCR>1-ステップ RT-qPCR (プローブ)

特徴

SARS-CoV-2(新型コロナウイルス)RNA 検出用のリアルタイム RT-PCR キット

本製品は研究用試薬です。

 

 

*新型コロナウイルス RNA の検出に関する最新論文とアプリケーションノートを公開しました(2020年4月9日)

 

特長

・新型コロナウイルス RNA の  N1 およびN2 領域 とヒト RNase P 遺伝子*を同時検出

・RNase P のリバースプライマーはエキソンジャンクションを挟んでいるため、ゲノム DNA 由来のバックグラウンドを低減

・4X RT-qPCR マスターミックスで、より多くのテンプレートの添加が可能、感度を上昇

・Luna WarmStart® RT と Hot Start Taq により、特異的で力強い増幅、かつ室温でのセットアップが可能

・マスターミックスに添加された UDG と dUTP により、キャリーオーバーによるコンタミネーションリスクを低減

・感度の低下を最小限に抑え、サンプルプーリングをサポート

*インターナルコントロール (IC)としての検出 ( サンプルの投入や阻害を確認するために用いられる )

 

本キットは、新型コロナウイルス RNA 検出用ワンステップ リアルタイム RT-PCR キットである (加水分解プローブ法)。単一のチューブ内において、RNA は逆転写酵素により cDNA に変換され、次にDNA ポリメラーゼが cDNA を増幅し、さらに増幅された DNA は蛍光によって検出される。

 

 

< 加水分解プローブ法について > 

リアルタイム PCR の手法の一つで、ターゲット領域を増幅させるプライマーと、末端をクエンチャーと蛍光色素で修飾されたプローブを使用する。このプローブはアニーリング時にプライマーで挟まれた領域にハイブリダイズし、伸長反応が行われる際、DNA ポリメラーゼの持つ 5' → 3' エキソヌクレアーゼ活性により切断されることで蛍光の検出が可能となる。この蛍光を PCR サイクルごとにモニタリングすることで DNA 増幅を測定する。バックグラウンドを超えた任意の蛍光値におけるサイクル数が Cq 値となり、これを 2 つ以上のサンプル間で比べることにより、相対的なターゲット量を評価することができる。

 

リアルタイム PCR の原理(NEB TV Japan: 日本語字幕付き動画)

 

 

図1、最大 94 サンプルの評価が可能 ( 96 ウェブプレート 1 枚当たり ) 

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96 ウェルプレート中、陰性コントロール ( Non-template Control ) と陽性コントロール ( Positive Control、キットに付属 ) を 1 ウェルずつ設ける。残りの 94 ウェルにサンプルをいれることができる。N2 領域は FAM、N1 領域は HEX、ヒト RNaseP は Cy5 で検出される。

 

< 検出パターンと評価の概要 >

  陰性コントロール   すべて検出されない
  陽性コントロール   N1、N2 のみ検出
  陰性サンプル   N1、N2 は検出されないが、RNaseP は検出される*
  陽性サンプル   N1、N2 は検出される、RNaseP は検出される または 検出されない**
  再評価 (擬陽性)   N1 または N2 の未検出。擬陽性。再評価が必要

* N1、N2、RNaseP が検出されない場合は、サンプルの添加がされなかった可能性もあるため、データは無効とする

** RNaseP が検出されない場合、サンプルの添加はされたが、検出できるほどの RNaseP が存在しなかったとし、判定は陽性と解釈する

 

予測される結果の詳細については、マニュアルを参照。

 

 

図2、キット内容

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本キットには、ワンステップRT-qPCR により、新型コロナウィルスRNA を検出するために必要なコンポーネントがすべて含まれている。

 

Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG ( マスターミックス、NEB# M3019 ) は UDG が含まれた 4x マスターミックスで、より多くのテンプレートの添加が可能でかつ UDG により、キャリーオーバーによるコンタミネーションのリスクを大幅に低減する。感度や特異性が高く、サンプルプーリングを行う場合も良好な検出が可能。独自のパッシブリファレンスも添加済みで、高 / 低 ROX リファレンスが必要なリアルタイム PCR 機器を含め、多くのリアルタイム PCR に使用することかできる。加えて、非蛍光のトラッキング色素*も含まれ、分注作業を視覚的にサポートする。

*qPCR で一般的に使用される蛍光のスペクトルとクロスオーバーしないため、リアルタイム検出を妨げない。

 

SARS-CoV-2 Positive Control ( N gene、NEB# N2117S ) は、プラスミドにクローニングされた新型コロナウイルス N 遺伝子。

 

SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X) は、N1、N2 領域とヒトRNaseP ( IC ) に対するプライマーおよび、プローブ。 プローブには、それぞれ異なる蛍光が修飾されており、異なるチャネルを使って同時に検出することができる ( N1:HEX、N2:FAM、RNaseP:Cy5 ) 。

 

 

図3. 検出部位

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A. SARS-CoV-2 のゲノム全体構造と検出部位 ( N1 / N2 領域 )

B. 内因性コントロール:RNase P の構造と検出部位

 

 

SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X) には、米国疾病予防管理センター( CDC ) が提供する配列に基づいた、新型コロナウイルスの N 遺伝子における 2 つの領域と、ヒト RNaseP ( IC ) に対する特異的なプライマーとプローブが含まれている。

 

IC として搭載されている RNaseP のリバースプライマーはCDC のデザインを改良し、エキソンジャンクションを挟んだ設計となっているため ( 図2.BのR ) 、ゲノム DNA の混入によるバックグラウンドを低減することができる。

キット内容

構成品:

Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG

SARS-CoV-2 Positive Control (N gene)

・SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X)

・Nuclease-free Water

 

保存温度:

-20℃