Luna SARS-CoV-2 RT-qPCR Multiplex Assay Kit
カタログ番号 |
サイズ |
濃度 |
価格(税別) |
保存温度 |
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E3019S | 96 rxns | ¥56,800 | -20C | |
E3019L | 480 rnxs | ¥252,000 | -20C |
製品カテゴリ>グループ
- リアルタイム PCR>1-ステップ RT-qPCR (プローブ)
備考
- 備考:価格改定 (2023年4月1日)
特徴
SARS-CoV-2(新型コロナウイルス)RNA 検出用のリアルタイム RT-PCR キット |
本製品は研究用試薬です。
*新型コロナウイルス RNA の検出に関する最新論文とアプリケーションノートを公開しました(2020年4月9日)
特長
・新型コロナウイルス RNA の N1 およびN2 領域 とヒト RNase P 遺伝子*を同時検出
・RNase P のリバースプライマーはエキソンジャンクションを挟んでいるため、ゲノム DNA 由来のバックグラウンドを低減
・4X RT-qPCR マスターミックスで、より多くのテンプレートの添加が可能、感度を上昇
・Luna WarmStart® RT と Hot Start Taq により、特異的で力強い増幅、かつ室温でのセットアップが可能
・マスターミックスに添加された UDG と dUTP により、キャリーオーバーによるコンタミネーションリスクを低減
・感度の低下を最小限に抑え、サンプルプーリングをサポート
*インターナルコントロール (IC)としての検出 ( サンプルの投入や阻害を確認するために用いられる )
本キットは、新型コロナウイルス RNA 検出用ワンステップ リアルタイム RT-PCR キットである (加水分解プローブ法)。単一のチューブ内において、RNA は逆転写酵素により cDNA に変換され、次にDNA ポリメラーゼが cDNA を増幅し、さらに増幅された DNA は蛍光によって検出される。
< 加水分解プローブ法について >
リアルタイム PCR の手法の一つで、ターゲット領域を増幅させるプライマーと、末端をクエンチャーと蛍光色素で修飾されたプローブを使用する。このプローブはアニーリング時にプライマーで挟まれた領域にハイブリダイズし、伸長反応が行われる際、DNA ポリメラーゼの持つ 5' → 3' エキソヌクレアーゼ活性により切断されることで蛍光の検出が可能となる。この蛍光を PCR サイクルごとにモニタリングすることで DNA 増幅を測定する。バックグラウンドを超えた任意の蛍光値におけるサイクル数が Cq 値となり、これを 2 つ以上のサンプル間で比べることにより、相対的なターゲット量を評価することができる。
リアルタイム PCR の原理(NEB TV Japan: 日本語字幕付き動画)
図1、最大 94 サンプルの評価が可能 ( 96 ウェブプレート 1 枚当たり )
96 ウェルプレート中、陰性コントロール ( Non-template Control ) と陽性コントロール ( Positive Control、キットに付属 ) を 1 ウェルずつ設ける。残りの 94 ウェルにサンプルをいれることができる。N2 領域は FAM、N1 領域は HEX、ヒト RNaseP は Cy5 で検出される。
< 検出パターンと評価の概要 >
陰性コントロール | すべて検出されない |
陽性コントロール | N1、N2 のみ検出 |
陰性サンプル | N1、N2 は検出されないが、RNaseP は検出される* |
陽性サンプル | N1、N2 は検出される、RNaseP は検出される または 検出されない** |
再評価 (擬陽性) | N1 または N2 の未検出。擬陽性。再評価が必要 |
* N1、N2、RNaseP が検出されない場合は、サンプルの添加がされなかった可能性もあるため、データは無効とする
** RNaseP が検出されない場合、サンプルの添加はされたが、検出できるほどの RNaseP が存在しなかったとし、判定は陽性と解釈する
予測される結果の詳細については、マニュアルを参照。
図2、キット内容
本キットには、ワンステップRT-qPCR により、新型コロナウィルスRNA を検出するために必要なコンポーネントがすべて含まれている。
Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG ( マスターミックス、NEB# M3019 ) は UDG が含まれた 4x マスターミックスで、より多くのテンプレートの添加が可能でかつ UDG により、キャリーオーバーによるコンタミネーションのリスクを大幅に低減する。感度や特異性が高く、サンプルプーリングを行う場合も良好な検出が可能。独自のパッシブリファレンスも添加済みで、高 / 低 ROX リファレンスが必要なリアルタイム PCR 機器を含め、多くのリアルタイム PCR に使用することかできる。加えて、非蛍光のトラッキング色素*も含まれ、分注作業を視覚的にサポートする。
*qPCR で一般的に使用される蛍光のスペクトルとクロスオーバーしないため、リアルタイム検出を妨げない。
SARS-CoV-2 Positive Control ( N gene、NEB# N2117S ) は、プラスミドにクローニングされた新型コロナウイルス N 遺伝子。
SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X) は、N1、N2 領域とヒトRNaseP ( IC ) に対するプライマーおよび、プローブ。 プローブには、それぞれ異なる蛍光が修飾されており、異なるチャネルを使って同時に検出することができる ( N1:HEX、N2:FAM、RNaseP:Cy5 ) 。
図3. 検出部位
A. SARS-CoV-2 のゲノム全体構造と検出部位 ( N1 / N2 領域 )
B. 内因性コントロール:RNase P の構造と検出部位
SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X) には、米国疾病予防管理センター( CDC ) が提供する配列に基づいた、新型コロナウイルスの N 遺伝子における 2 つの領域と、ヒト RNaseP ( IC ) に対する特異的なプライマーとプローブが含まれている。
IC として搭載されている RNaseP のリバースプライマーはCDC のデザインを改良し、エキソンジャンクションを挟んだ設計となっているため ( 図2.BのR ) 、ゲノム DNA の混入によるバックグラウンドを低減することができる。
プロトコール
技術資料
・アプリケーションノート: Luna試薬を使った機械化によるハイスループット・ワークフロー ( 英語 )
・アプリケーションノート:生体サンプルからの新型コロナウイルス RNA ( 合成 )の精製
・Monarch Total RNA Miniprep Kit を使った、唾液 / 口腔スワブ / 鼻咽頭スワブ からのRNA 精製 プロトコール
・輸送液等に保存された唾液 / 口腔スワブ / 鼻咽頭スワブ からのRNA 精製 プロトコール (クイックプロトコール)
キット内容
構成品:
・Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix with UDG
・SARS-CoV-2 Positive Control (N gene)
・SARS-CoV-2 Primer/Probe Mix (N1/N2/RP) (10X)
・Nuclease-free Water
保存温度:
-20℃