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Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood

Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Bloodカタログ番号:T3050

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

T3050S 5 preps ¥12,600 室温
T3050L 50 preps ¥72,000 室温

製品カテゴリ>グループ

  • 核酸精製キット>ゲノムDNA精製

備考

  • 備考:一部試薬では、開封後、4C/-20Cでの保管が必要

特徴

高分子ゲノム DNA 精製キット(細胞、血液用) 組織、酵母、バクテリア用キットも販売中

 

特長

 

・培養細胞、血液からゲノム DNA を精製 image
・メガベース(Mb)の DNA を単離可能
・溶解中の攪拌速度を調整するだけで DNA サイズを調整
・簡単・迅速(細胞:30 分、血液:60 分)
・高純度でインタクトな DNA を高収量で精製
・RNA も高効率で除去
・RNase A と Proteinase K が付属 特殊なガラスビーズで精製
・ロングリード・シーケンスのインプット DNA 調製に最適  
  サンプルリクエスト受付中 

 

 

The Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood は、培養細胞と血液から高分子(High Molecular Weight、HMW)のインタクトなゲノム DNA を精製するためのキットである。


プロトコールが最適化されており、Proteinase K で消化、続いてタンパク質除去ステップとガラスビーズ表面へのDNA沈殿をおこなう。これにより標準プロトコールでは 50-250 kbの DNA、攪拌速度を低くすることで Mb レベルの DNA を精製できる。Lysis Buffer には RNase A が含まれているため RNA がほぼ完全に除去されており、高純度、高収率、短時間でゲノム DNA を精製できる(細胞:30 分、血液:60 分)。標準的な精製度は以下のとおり。


・A260/280 = 1.8 - 1.9

・A260/230 = 2.2 - 2.5


本キットで精製した HMW DNA は、ロングリード・シーケンシング(Oxford Nanopore Technologies®およびPacific Biosciences®)、光学マッピング(Bionano Genomics®)、リンクリードゲノムアセンブリなど、より長いサイズのゲノムを必要とするアプリケーションに適している。

 

 

表 1、検証済みサンプル *
  細胞 血液(哺乳類)** 血液(無核)**
  HEK293 ヒト ニワトリ
  HeLa マウス シチメンチョウ
  NIH3T3 ラット  
  Jurkat ウサギ  
  K562 (suspension cells) ブタ  
  HCT116 ウマ  
  A549 ウシ  
  U5Os アカゲザル  
  HepG2 ヤギ  
  NCI-460    
  SK-N-SH    
  Aa23    収量データ詳細
       
   * 新鮮(未凍結)なサンプルと凍結サンプルのそれぞれで検証
   ** 一般的な抗凝固剤を併用可能

 

 

図 1、培養細胞からのゲノム DNA 精製ワークフロー

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1、溶解:細胞を Nuclei Prep Buffer に懸濁(RNase A 含む)、Proteinase K と Lysis Buffer を添加して 56 ℃ で 10 分間、攪拌する。

2、凝集:ビーズ等を加えてゲノム DNA を凝集、ビーズ上に補足する

3、洗浄:Wash Buffer で 2 回洗浄する

4、溶解:Elution Buffer を加えて 56 ℃、5 分間で溶解する

5、溶出:遠心して溶出する

 

 

図 2、血液からのゲノム DNA 精製ワークフロー

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1、溶血:全血に対して 3 倍量の Lysis Buffer を加え、氷上でインキュベートした後、遠心する

2、洗浄( 1 回目):上清を破棄して、再度 Lysis Buffer を加えて遠心する

3、洗浄( 2 回目):上清を破棄して、PBS を加えて遠心する

4、溶解:上清を破棄して、Nuclei Prep Buffer を添加(Proteinase K と RNase A 含む)、56 ℃ で 10 分間、攪拌する

5、凝集:ビーズ等を加えてゲノム DNA を凝集、ビーズ上に補足する

6、洗浄:Wash Buffer で 2 回洗浄する

7、溶解:Elution Buffer を加えて 56 ℃、5 分間で溶解する

8、溶出:遠心して溶出する



図 3、高い再現性で細胞と血液から高分子ゲノム DNA を精製

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HEK 293 細胞(1 x 106 cells)とヒト新鮮血(500 ul)から推奨標準プロトコールに従ってゲノム DNA を精製した結果、サンプル間で効率、精製度に違いはほとんどなく、再現性が高く精製できることが示された。また溶解中の攪拌速度を変えたところ、低速度(300 RPM)では非常に高い分子量のゲノム DNA が、標準速度(2,000 RPM)では 50-250 bpのゲノム DNA が精製された。サンプル種と攪拌速度をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製 DNA 500 ng を PFGE に供した(1% アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒)。マーカー(M)は Lambda PFG Ladder(NEB#N0341)を使用。



図 4、溶解中の攪拌速度によりゲノムサイズを調整可能

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HEK 293 細胞(1 x 106 cells)とヒト新鮮血(500 ul)から、溶解中の攪拌速度を変えてゲノム DNA を精製した結果、攪拌速度の調整によりゲノムサイズを調整できることが示された。サンプル種をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製DNA(細胞由来:500 ng、血液由来:650 ng)を PFGE に供した(1% アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒)。マーカー(M)は Lambda PFG Ladder(NEB#N0341)を使用。

 

 

図 5、サンプル量と精製 DNA 量は高い相関性を示す

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精製に用いた HEK293 細胞とヒト新鮮血の初期量と、精製された DNA 量をプロットしたところ、サンプル量と精製 DNA 量が高い相関性を示すことが示された。血液は白血球数の異なるドナーの新鮮血を使用したが、どちらの場合も100 µl ~ 2,000 µlの範囲において、 サンプル量と精製DNA量で直線性が示された。それぞれの実験において、同じサンプルを希釈することで 5 点の初期量を作成、5 x 105 以下の細胞および 500 µl 未満の血液サンプルは低投入サンプルの推奨量を使用して、標準プロトコールで精製した(攪拌速度:2,000 RPM)。

 

 

表 2、Oxford Nanopore でのシーケンス例 

 

HEK 293 細胞

1 x 106 cells

ヒト 全血

500 ul

マウス 腎臓

10 mg

 使用キット

T3050 T3050 T3060
 Mean read length (bp) 21,339 21,523 27,121
 Mean read quality 12.8 13.4 13
 Median read length (bp) 10,388 10,130 23,150
 Median read quality 13.2 13.9 13.5
 Number of reads 377,687 538,090 164,000
 Read length N50 (bp) 45,432 46,542 44,631
 Total bases 8059414490
(8.1 Gb)
11581090785
(11.6 Gb)
4447789727
(4.4 Gb)

各検体からMonarch でゲノムDNA を精製、NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (NEB #E7180)でライブラリー調製、GridION Mk1(LSK109 kit, FLO-MIN106D flow cell)でシーケンス(最大48 時間)。

ガイドライン & FAQ

・ガイドライン

   ・目的の DNA サイズを精製するための溶解中の攪拌速度 (英語)

   ・精製に使用できるインプットサンプルの量 (英語)

   ・Nanopore シーケンスでの実施例 (英語)

   ・パルスフィールド電気泳動に HMW DNA をローディングするときの注意 (英語)

   ・溶出後の HMW DNA の均一化 (英語)

   ・精製に使用するインプットサンプルの種類 (英語)

   ・HMW DNA の測定および保存 (英語)


FAQ (よくあるお問合せ)


トラブルシューティング

 

・動画    
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Monarch ゲノム精製キット (細胞 & 血液) の原理とワークフロー使い方

日本語字幕付き

 

Monarch ゲノム精製キットの紹介

英語、Webinar (オンデマンド)

キット内容

キット内容:

Monarch RBC Lysis Buffer

Monarch gDNA Nuclei Prep Buffer

Monarch gDNA Nuclei Lysis Buffer

Monarch Precipitation Enhancer

Monarch gDNA Wash Buffer

Monarch gDNA Elution Buffer II

Proteinase K, Molecular Biology Grade

Monarch RNase A

Monarch DNA Capture Beads

Monarch 2 ml Tubes

Monarch Bead Retainers

Monarch Collection Tubes II

*各構成品は単品購入可能です。キット構成品とは容量が異なる場合があります。

 

保存温度:

室温(未開封時)。

ただし開封後、以下の構成品は冷蔵もしくは冷凍保存する。

・Monarch RBC Lysis Buffer : 4 ℃

・Monarch RNase A : -20 ℃

・Proteinase K, Molecular Biology Grade : -20 ℃