特徴

特長
・培養細胞、血液からゲノム DNA を精製
・メガベース（Mb）の DNA を単離可能
・溶解中の攪拌速度を調整するだけで DNA サイズを調整
・簡単・迅速（細胞：30 分、血液：60 分）
・高純度でインタクトな DNA を高収量で精製
・RNA も高効率で除去
・RNase A と Proteinase K が付属	特殊なガラスビーズで精製
・ロングリード・シーケンスのインプット DNA 調製に最適
	サンプルリクエスト受付中

The Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood は、培養細胞と血液から高分子（High Molecular Weight、HMW）のインタクトなゲノム DNA を精製するためのキットである。

プロトコールが最適化されており、Proteinase K で消化、続いてタンパク質除去ステップとガラスビーズ表面へのDNA沈殿をおこなう。これにより標準プロトコールでは 50-250 kbの DNA、攪拌速度を低くすることで Mb レベルの DNA を精製できる。Lysis Buffer には RNase A が含まれているため RNA がほぼ完全に除去されており、高純度、高収率、短時間でゲノム DNA を精製できる（細胞：30 分、血液：60 分）。標準的な精製度は以下のとおり。

・A260/280 = 1.8 - 1.9

・A260/230 = 2.2 - 2.5

本キットで精製した HMW DNA は、ロングリード・シーケンシング（Oxford Nanopore Technologies®およびPacific Biosciences®）、光学マッピング（Bionano Genomics®）、リンクリードゲノムアセンブリなど、より長いサイズのゲノムを必要とするアプリケーションに適している。

図 1、培養細胞からのゲノム DNA 精製ワークフロー

１、溶解：細胞を Nuclei Prep Buffer に懸濁（RNase A 含む）、Proteinase K と Lysis Buffer を添加して 56 ℃ で 10 分間、攪拌する。

２、凝集：ビーズ等を加えてゲノム DNA を凝集、ビーズ上に補足する

３、洗浄：Wash Buffer で 2 回洗浄する

４、溶解：Elution Buffer を加えて 56 ℃、5 分間で溶解する

５、溶出：遠心して溶出する

図 2、血液からのゲノム DNA 精製ワークフロー

１、溶血：全血に対して 3 倍量の Lysis Buffer を加え、氷上でインキュベートした後、遠心する

２、洗浄（ 1 回目）：上清を破棄して、再度 Lysis Buffer を加えて遠心する

３、洗浄（ 2 回目）：上清を破棄して、PBS を加えて遠心する

４、溶解：上清を破棄して、Nuclei Prep Buffer を添加（Proteinase K と RNase A 含む）、56 ℃ で 10 分間、攪拌する

５、凝集：ビーズ等を加えてゲノム DNA を凝集、ビーズ上に補足する

６、洗浄：Wash Buffer で 2 回洗浄する

７、溶解：Elution Buffer を加えて 56 ℃、5 分間で溶解する

８、溶出：遠心して溶出する

図 3、高い再現性で細胞と血液から高分子ゲノム DNA を精製

HEK 293 細胞（1 x 10⁶ cells）とヒト新鮮血（500 ul）から推奨標準プロトコールに従ってゲノム DNA を精製した結果、サンプル間で効率、精製度に違いはほとんどなく、再現性が高く精製できることが示された。また溶解中の攪拌速度を変えたところ、低速度（300 RPM）では非常に高い分子量のゲノム DNA が、標準速度（2,000 RPM）では 50-250 bpのゲノム DNA が精製された。サンプル種と攪拌速度をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製 DNA 500 ng を PFGE に供した（1％ アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒）。マーカー（M）は Lambda PFG Ladder（NEB＃N0341）を使用。

図 4、溶解中の攪拌速度によりゲノムサイズを調整可能

HEK 293 細胞（1 x 10⁶ cells）とヒト新鮮血（500 ul）から、溶解中の攪拌速度を変えてゲノム DNA を精製した結果、攪拌速度の調整によりゲノムサイズを調整できることが示された。サンプル種をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製DNA（細胞由来：500 ng、血液由来：650 ng）を PFGE に供した（1％ アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒）。マーカー（M）は Lambda PFG Ladder（NEB＃N0341）を使用。

図 5、サンプル量と精製 DNA 量は高い相関性を示す

精製に用いた HEK293 細胞とヒト新鮮血の初期量と、精製された DNA 量をプロットしたところ、サンプル量と精製 DNA 量が高い相関性を示すことが示された。血液は白血球数の異なるドナーの新鮮血を使用したが、どちらの場合も100 µl ～ 2,000 µlの範囲において、 サンプル量と精製DNA量で直線性が示された。それぞれの実験において、同じサンプルを希釈することで 5 点の初期量を作成、5 x 10⁵ 以下の細胞および 500 µl 未満の血液サンプルは低投入サンプルの推奨量を使用して、標準プロトコールで精製した（攪拌速度：2,000 RPM）。

表 2、Oxford Nanopore でのシーケンス例 

各検体からMonarch でゲノムDNA を精製、NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing （NEB #E7180）でライブラリー調製、GridION Mk1（LSK109 kit, FLO-MIN106D flow cell）でシーケンス（最大48 時間）。