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Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue

Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissueカタログ番号:T3060

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

T3060S 5 preps ¥13,500 室温
T3060L 50 preps ¥81,000 室温

製品カテゴリ>グループ

  • 核酸精製キット>ゲノムDNA精製

備考

  • 備考:キット内の構成品の一部は開封後4C/-20Cで保管

特徴

高分子ゲノム DNA精製キット(組織、酵母、バクテリア等用) 培養細胞&血液用キットも販売中

 

特長  
・様々な組織、生物(表 1) からゲノム DNA を精製 image
・軟組織とバクテリアの場合、メガベース(Mb)の DNA を単離可能
・溶解中の攪拌速度を調整するだけで DNA サイズを調整(サンプルによる)
・簡単・迅速(組織とバクテリアの場合、90 分)
・高純度でインタクトな DNA を高収量で精製
・RNase A と Proteinase K、マイクロチューブ乳棒が添付 特殊なガラスビーズで精製
・ロングリード・シーケンスのインプット DNA 調製に最適  
  サンプルリクエスト受付中 

 

Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue は、様々な組織やバクテリア、酵母、昆虫、両生類などから高分子(High Molecular Weight、HMW)のインタクトなゲノム DNA を精製するためのキットである。サンプルによってプロトコールが最適化されている。


・組織:マイクロチューブ乳棒で攪拌して Proteinase K で消化、続いてタンパク質除去ステップとガラスビーズ表面への DNA 沈殿をおこなう。

 

・バクテリア:細菌の細胞壁を効率的に溶解するためにリゾチームを利用、続いて Proteinase K 消化、タンパク質除去ステップとガラスビーズ表面への DNA 沈殿を行う。


精製 DNA サイズは、標準プロトコールでは 50〜500 kbの範囲、軟組織およびバクテリアの場合、攪拌速度を低くすることで Mb レベルとなる。Lysis Buffer には RNase A が含まれているため RNA をほぼ完全に除去することができ、高純度かつ高収率でゲノム DNA を精製できる。組織やバクテリアの場合、90 分で精製が完了する。標準的な精製度は以下のとおり。


・組織:A260/280 = 1.8 - 1.9、A260/230 = 2.1 - 2.5

 

・バクテリア: A260/280 = 1.8 - 1.9、A260/230 = 2.1 - 2.2


本キットで精製した HMW DNA は、ロングリード・シーケンシング(Oxford Nanopore Technologies® および Pacific Biosciences®)、光学マッピング(Bionano Genomics®)、リンクリードゲノムアセンブリなど、より長いサイズのゲノムを必要とするアプリケーションに適している。

 

 

表 1、実証サンプル例
組織(哺乳類)* バクテリア 両生類  酵母 昆虫 
・マウス 脳 ・Escherichia coli ・アフリカツメガエル ・S. cerevisiae ・ネッタイシマカ
・マウス 肝臓  (グラム陽性)  (Xenopus laevis)    (A. aegypti)
・マウス 筋肉 ・Bacillus cereus      
・マウス 腎臓  (グラム陰性)      
・マウス 尾  ・Micrococcus leuteus      
・マウス 耳  (グラム陽性)      
・ラット 腎臓        収量データ詳細
         
  * フレッシュおよび凍結サンプルの両方で実証

 

 

図 1、組織からのゲノムDNA精製ワークフロー

image

1、ホモジェナイズ:キット付属の乳棒で破砕する。ローター式攪拌でも良い。

2、溶解:Proteinase K と Lysis Buffer を添加して 56 ℃ で 45 分間、攪拌する。RNase A を添加して 10 分間攪拌する。

3、分離:ゲノム DNA とタンパク質の分離

4、凝集:ビーズ等を加えてゲノム DNA を凝集、ビーズ上に捕捉する

5、洗浄:Wash Buffer で 2 回洗浄する

6、溶解:Elution Buffer を加えて 56 ℃、5 分間で溶解する

7、溶出:遠心して溶出する



図 2、様々なサンプルで高分子ゲノム DNA を精製

image

各種サンプルから推奨標準プロトコールに従って(2,000 rpm で攪拌)ゲノム DNA を精製したところ(S.cerevisiae は酵母専用プロトコールを使用)、高純度で高分子のゲノム DNA が精製されたことが示された。サンプル種をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製 DNA 500 ng を PFGE に供した(1% アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒)。マーカー(M)はLambda PFG Ladder(NEB#N0341)を使用。



図 3、溶解中の攪拌速度によりゲノムサイズを調整可能

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マウス腎臓(10 mg、A)と大腸菌(1 x 109 cells、B)を用いて、溶解中の攪拌速度を変えてゲノム DNA を精製した結果、攪拌速度の調整によりゲノムサイズを調整できることが示された。サンプル種をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製 DNA 300 ng(腎臓由来 DNA)と500 ng(大腸菌由来 DNA)を PFGE に供した(1% アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、角度 120°、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒)。マーカー(M)はLambda PFG Ladder(NEB#N0341)を使用。

 

 

表 2、Oxford Nanopore でのシーケンス例

 

HEK 293 細胞

1 x 106 cells

ヒト 全血

500 ul

マウス 腎臓

10 mg

 使用キット

T3050 T3050 T3060 
 Mean read length (bp) 21,339 21,523 27,121
 Mean read quality 12.8 13.4 13
 Median read length (bp) 10,388 10,130 23,150
 Median read quality 13.2 13.9 13.5
 Number of reads 377,687 538,090 164,000
 Read length N50 (bp) 45,432 46,542 44,631
 Total bases 8059414490
(8.1 Gb)
11581090785
(11.6 Gb)
4447789727
(4.4 Gb)

各検体からMonarch でゲノムDNA を精製、NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing (NEB #E7180)でライブラリー調製、GridION Mk1(LSK109 kit, FLO-MIN106D flow cell)でシーケンス(最大48 時間)。

キット内容

Monarch HMW gDNA Tissue Lysis Buffer

Monarch Protein Separation Solution

Proteinase K, Molecular Biology Grade

Monarch RNase A

Monarch gDNA Wash Buffer

Monarch gDNA Elution Buffer II

Monarch DNA Capture Beads

Monarch Pestle Tubes

Monarch Pestles

Monarch 2 ml Tubes

Monarch Bead Retainers

Monarch Collection Tubes II

*各構成品は単品購入可能です。キット構成品とは容量が異なる場合があります。

 

保存温度:

室温(未開封時)。

ただし開封後、以下の構成品は冷蔵もしくは冷凍保存する。

・Monarch RNase A : -20 ℃

・Proteinase K, Molecular Biology Grade : -20 ℃