特徴

特長
・様々な組織、生物（表 1) からゲノム DNA を精製
・軟組織とバクテリアの場合、メガベース（Mb）の DNA を単離可能
・溶解中の攪拌速度を調整するだけで DNA サイズを調整（サンプルによる）
・簡単・迅速（組織とバクテリアの場合、90 分）
・高純度でインタクトな DNA を高収量で精製
・RNase A と Proteinase K、マイクロチューブ乳棒が添付	特殊なガラスビーズで精製
・ロングリード・シーケンスのインプット DNA 調製に最適
	サンプルリクエスト受付中

Monarch HMW DNA Extraction Kit for Tissue は、様々な組織やバクテリア、酵母、昆虫、両生類などから高分子（High Molecular Weight、HMW）のインタクトなゲノム DNA を精製するためのキットである。サンプルによってプロトコールが最適化されている。

・組織：マイクロチューブ乳棒で攪拌して Proteinase K で消化、続いてタンパク質除去ステップとガラスビーズ表面への DNA 沈殿をおこなう。

・バクテリア：細菌の細胞壁を効率的に溶解するためにリゾチームを利用、続いて Proteinase K 消化、タンパク質除去ステップとガラスビーズ表面への DNA 沈殿を行う。

精製 DNA サイズは、標準プロトコールでは 50〜500 kbの範囲、軟組織およびバクテリアの場合、攪拌速度を低くすることで Mb レベルとなる。Lysis Buffer には RNase A が含まれているため RNA をほぼ完全に除去することができ、高純度かつ高収率でゲノム DNA を精製できる。組織やバクテリアの場合、90 分で精製が完了する。標準的な精製度は以下のとおり。

・組織：A260/280 = 1.8 - 1.9、A260/230 = 2.1 - 2.5

・バクテリア： A260/280 = 1.8 - 1.9、A260/230 = 2.1 - 2.2

本キットで精製した HMW DNA は、ロングリード・シーケンシング（Oxford Nanopore Technologies® および Pacific Biosciences®）、光学マッピング（Bionano Genomics®）、リンクリードゲノムアセンブリなど、より長いサイズのゲノムを必要とするアプリケーションに適している。

図 1、組織からのゲノムDNA精製ワークフロー

１、ホモジェナイズ：キット付属の乳棒で破砕する。ローター式攪拌でも良い。

２、溶解：Proteinase K と Lysis Buffer を添加して 56 ℃ で 45 分間、攪拌する。RNase A を添加して 10 分間攪拌する。

３、分離：ゲノム DNA とタンパク質の分離

４、凝集：ビーズ等を加えてゲノム DNA を凝集、ビーズ上に捕捉する

５、洗浄：Wash Buffer で 2 回洗浄する

６、溶解：Elution Buffer を加えて 56 ℃、5 分間で溶解する

７、溶出：遠心して溶出する

図 2、様々なサンプルで高分子ゲノム DNA を精製

各種サンプルから推奨標準プロトコールに従って（2,000 rpm で攪拌）ゲノム DNA を精製したところ（S.cerevisiae は酵母専用プロトコールを使用）、高純度で高分子のゲノム DNA が精製されたことが示された。サンプル種をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製 DNA 500 ng を PFGE に供した（1％ アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒）。マーカー（M）はLambda PFG Ladder（NEB＃N0341）を使用。

図 3、溶解中の攪拌速度によりゲノムサイズを調整可能

マウス腎臓（10 mg、A）と大腸菌（1 x 10⁹ cells、B）を用いて、溶解中の攪拌速度を変えてゲノム DNA を精製した結果、攪拌速度の調整によりゲノムサイズを調整できることが示された。サンプル種をゲル上部、量と収量、純度を下部に示す。精製 DNA 300 ng（腎臓由来 DNA）と500 ng（大腸菌由来 DNA）を PFGE に供した（1％ アガロースゲル、6 V / cm、13 ℃ で 20 時間、角度 120°、BioRad CHEF-DR III システム、switch time は 0.5〜94 秒）。マーカー（M）はLambda PFG Ladder（NEB＃N0341）を使用。

表 2、Oxford Nanopore でのシーケンス例

各検体からMonarch でゲノムDNA を精製、NEBNext® Companion Module for Oxford Nanopore Technologies Ligation Sequencing （NEB #E7180）でライブラリー調製、GridION Mk1（LSK109 kit, FLO-MIN106D flow cell）でシーケンス（最大48 時間）。