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NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina)

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina)カタログ番号:E7658

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E7658S 24 rxns ¥72,000 -20C/室温
E7658L 96 rxns ¥288,000 -20C/室温

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用(DNA, ChIP, mRNA, Small RNA)

特徴

新変異株に対応するため、VarSkip Short Primers から VarSkip Short v2 Primer に変更 (2022 年 3 月)

 

新型コロナウイルスの全ゲノムシーケンス用ライブラリー調製キット(Illumina、2 x 75 bp)

Illumina 用(2 x 250 bp)

Nanopore 用

 

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本製品は 新型コロナウイルス:SARS-CoV-2 の RNA ゲノムシーケンス用のライブラリー調製キットである(Illumina 用)。ARTIC Network との共同研究の下、ARTIC SARS-CoV-2 プロトコール に基づいて開発された。RNA ゲノム全体をカバーするように各領域を逆転写・増幅して、そのアンプリコンから約 150 bp のインサートサイズの Illumina 用ライブラリーを調製、2 x 75 bp の次世代シーケンスにより全ゲノム解析を行う(図1&7)。

 

オリジナルプロトコール*1ではゲノムカバレッジと depth の均一性に問題があったが、NEBNext ARTIC では、プロトコールの改良と各領域増幅のためのプライマーの最適化により、新型コロナウイルスゲノムをほぼ完全にカバーかつ均一な depth でシーケンスできる。NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer の配列は ARTIC Network V3 primers と同じであり、約 400 bp の cDNA を合成・増幅する (cDNA は 150 bp に断片化された後にライブラリーが調製される)。

 

さらに 2021 年 10 月下旬より、デルタ株を含む新変異株により対応した VarSkip Short Primer をキットに追加、これをオミクロン株にも対応すべく VarSkip Short v2 Primer にアップデートした (2022 年 3 月) 。キットには NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer (= ARTIC Network V3 primers) と VarSkip Short v2 Primer が含まれており、いずれかを選択してライブラリー調製ができる (2 種類のプライマーの違い)。

 

特長:

・新型コロナウイルスの全ゲノムシーケンス解析が可能(Illumina 機種対応)

・ARTIC Network の協力によりプロトコール開発およびプライマー改良(ARTIC Network V3 primers と同じ配列)

・ゲノムカバレッジと depth の均一性が大きく向上

・10〜10,000 コピーのウイルスゲノム RNA から調製

・インプット量によらない共通したプロトコール、cDNA 増幅時のノーマライズも不要

・ヒト・コントロールプライマー、DNA 精製ビーズが付属

New デルタ株およびオミクロン株を含む新変異株により対応した VarSkip Short v2 Primer をキットに追加・アップデート

・cDNA 合成後およびアダプターライゲーション後のビーズ精製をスキップした Express プロトコールを公開 (マニュアル Chapter 1 参照)

 

 

ARTIC Network とは:

Wellcome Trust 財団の⽀援によって設立・運営されている組織である。ARTIC(Advancing Real Time Infection Control)の名が示すように、ウイルスのサンプリング、核酸処理、シーケンス、データ解析などの情報やシステムを開発している。

 

これによりアウトブレイクから公衆衛生機関によるリアルタイムの疫学情報の取得まで、end-to-endに対応することを目的としている。これまでにエボラウイルスやジカウイルスなどの検出プロトコールを開発している。特に新型コロナ感染症対策においては、変異速度が速いSARS-CoV-2 ウイルスのゲノムシーケンスの基盤となる方法を開発、国立感染症研究所や世界各国の感染症センターで使用されている。

ARTIC Nextwork ホームページ

 

ARTIC SARS-CoV-2 プロトコールとは:

新型コロナウイルスの全ゲノムをシーケンスするためのプロトコールである。ゲノムの各領域から cDNA を合成、増幅したアンプリコンからライブラリーを調製してシーケンスする。オリジナルプロトコール*1においては、Oxford Nanopore Technologies 社シーケンスでは 400 bp、Illumina 社シーケンスでは 150 bp(2 x 75 bp)または 400 bp(2 x 250 bp)のインサートサイズのライブラリーからリードを取得する。

*1 ARTIC SARS-CoV-2 プロトコール:Josh Quick 2020. nCoV-2019 sequencing protocol v2 (GunIt)

 

NEBNext ARTIC kits とは:

ARTIC SARS-CoV-2 プロトコールに基づいたライブラリー調製キットである。通常の NEBNext キットとは異なり、SARS-CoV-2 ウイルスゲノムの各領域を増幅するための専用プライマーが付属する。NEB 独自の改良によりゲノム全体のカバー率と coverage depth の均一性を向上、さらに 10-10,000 コピーからもライブラリーを調製できる。、Nanopore と Illumina シーケンサーに対応したキットを提供している。

 

2 種類のプライマーの違い:

NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer:ARTIC Network V3 primers と同じ配列を持つ。ゲノムの各領域から約 400 bp の cDNA を合成 (cDNA は断片化されて 150 bp のインサートとなる)。NEB でプライマー濃度が最適化されており、均一な cDNA が合成できる。販売当初からキットに付属。


VarSkip Short v2 Primer:新変異株の変異箇所による影響を低減、より正確かつ確実に cDNA が合成されるように NEB でデザインされたプライマーである。ゲノムの各領域から約 550 bp の cDNA を合成 (cDNA は断片化されて 150 bp のインサートとなる)。

 

 

 

 

図1:NEBNext ARTIC kit のワークフロー

 

A) RNA サンプルから逆転写反応により cDNA を合成、PCR により各領域を増幅する。ここまでは Illumina と Nanopore シーケンスで共通である。PCR で増幅したアンプリコンから、各社シーケンスに合わせたライブラリーを調製する。元々は Nanopore 用の ARTIC プロトコールが開発されたが、大量のサンプルのハイスループット解析のニーズなどにより、Illumina 用プロトコールが開発された。

 

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B) 各フローの所要時間

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図2:独自のプライマーにより、ゲノム全体をカバーしたシーケンスが可能 (NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer)

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ARTIC オリジナルと NEBNext ARTIC で 2 株の新型コロナウイルスのゲノムシーケンスを実施、得られたリードをゲノムにマッピングして coverage と coverage depth を視覚化した。ARTIC オリジナルではゲノムの一部の depth が低かった。一方、NEBNext ARTIC では、ゲノムをほぼ完全にカバーしており、均一な coverage depth が取得されていることが示された。また、ヒト・コントロールプライマーを使用した場合でも、ウイルスゲノムの coverage は変わらず、その影響がないことが示された。実験の概要は以下のとおり:

 

・インプット:1,000 コピーの 新型コロナウイルス RNA ゲノム(ATCC VR-1986、VR-1991)を 100 ng のヒト RNA(Universal Human Reference RNA、ThermoFisher QS0639)に混ぜたもの

 

・cDNA 合成:IDT ARTIC nCoV-2019 V3 Panel(ARTIC オリジナル)、または NEBNext balanced ARTIC SARS-CoV-2 primer pools(NEBNext ARTIC) を使用

 

・ライブラリー調製:NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina) でライブラリー調製

 

・シーケンス:MiSeq(2x75 bp)でシーケンス

 

 

 

 

図 3:Coverage depth が向上 (NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer)

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10 - 10,000 コピーのウイルスゲノム RNA からライブラリーを調製、ゲノムシーケンスを実施したところ、すべてのコピー数においてNEBNext ARTIC で高い coverage depth が得られることが示された。


・インプット:10 - 10,000 コピーの SARS-CoV-2 RNAゲノム(ATCC VR-1986、VR-1991)と 100 ngのヒト RNA(Universal Human Reference RNA、ThermoFisher QS0639)に混ぜたもの

 

・cDNA 合成:IDT ARTIC nCoV-2019 V3 Panel(ARTIC オリジナル)、または NEBNext balanced ARTIC SARS-CoV-2 primer pools(NEBNext ARTIC) を使用

 

・ライブラリー調製:NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina) でライブラリー調製

 

・シーケンス:MiSeq(2x75 bp)でシーケンス

 

・解析:seqtk でダウンサンプル後、Bowtie2 でリファレンスゲノム(NCBI, NC_045512)にアライメント、塩基当たりの coverage を算出

 

 

 

 

図 4:ヒト・コントロールプライマーはゲノムカバレッジに影響なし (NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer)

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1,000 コピーのウイルスゲノム RNA からライブラリーを調製、ゲノムシーケンスを実施したところ、ヒト・コントロールプライマーの有無に関わらず同じデータが得られたことから、ウイルスゲノムをシーケンスしつつ、同時にヒトコントロールが取れることが示された。

 

・インプット:1,000 コピーの SARS-CoV-2 RNAゲノム(ATCC VR-1986、VR-1991)と 100 ngのヒト RNA(Universal Human Reference RNA、ThermoFisher QS0639)に混ぜたもの

 

・cDNA 合成:IDT ARTIC nCoV-2019 V3 Panel(ARTIC オリジナル)、または NEBNext balanced ARTIC SARS-CoV-2 primer pools(NEBNext ARTIC) を使用

 

・ライブラリー調製:NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina) でライブラリー調製

 

・シーケンス:MiSeq(2x75 bp)でシーケンス

 

・解析:seqtk で 10,000、100,000、500,000、1,000,000 にダウンサンプル後、各 depth のゲノムカバー画分を算出

 

 

 

 

図 5:他社キットとの ゲノムカバレッジの比較 (1) (NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer)

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NEBNext ARTIC と他社キットで 2 株の新型コロナウイルスのゲノムシーケンスを実施、得られたリードをゲノムにマッピングして coverage と coverage depth を視覚化した。他社キットではゲノムの一部の depth が低かった。一方、NEBNext ARTIC では、ゲノムをほぼ完全にカバーしており、均一な coverage depth が取得されていることが示された。また、ヒト・コントロールプライマーを使用した場合でも、ウイルスゲノムの coverage は変わらず、その影響がないことが示された。実験の概要は以下のとおり:

 

・インプット:1,000 コピーの 新型コロナウイルス RNA ゲノム(ATCC VR-1986、VR-1991)を 100 ng のヒト RNA(Universal Human Reference RNA、ThermoFisher QS0639)に混ぜたもの

 

・cDNA 合成:QIAseq SARS-CoV-2 Primer Panel、または NEBNext balanced ARTIC SARS-CoV-2 primer pools(NEBNext ARTIC) を使用

 

・ライブラリー調製:QIAseqFX kit、またはNEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina) でライブラリー調製

 

・シーケンス:MiSeq(2x75 bp)でシーケンス

 

・解析:seqtk でダウンサンプル後、Bowtie2 でリファレンスゲノム(NCBI, NC_045512)にアライメント

 

 

 

 

図 6:他社キットとのゲノムカバレッジの比較 (2) (NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer)

 

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1,000 コピーのウイルスゲノム RNA からライブラリーを調製、ゲノムシーケンスを実施したところ、ヒト・コントロールプライマーの有無に関わらず同じデータが得られたことから、ウイルスゲノムをシーケンスしつつ、同時にヒトコントロールが取れることが示された。

 

すべてのコピー数においてNEBNext ARTIC で高い coverage depth が得られることが示された。

 

・インプット:10 - 10,000 コピーの SARS-CoV-2 RNAゲノム(ATCC VR-1986、VR-1991)と 100 ngのヒト RNA(Universal Human Reference RNA、ThermoFisher QS0639)に混ぜたもの

 

・cDNA 合成:IDT ARTIC nCoV-2019 V3 Panel(ARTIC オリジナル)、または NEBNext balanced ARTIC SARS-CoV-2 primer pools(NEBNext ARTIC) を使用

 

・ライブラリー調製:NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina) でライブラリー調製

 

・シーケンス:MiSeq(2x75 bp)でシーケンス

 

・解析:seqtk で 10,000、100,000、500,000、1,000,000 にダウンサンプル後、各 depth のゲノムカバー画分を算出

 

 

 

 

図 7:新しく設計されたプライマーでオミクロン株の全ゲノム解析のカバレッジが向上 (VarSkip Short v2 Primer)

 

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Integrative Genome Viewer visualization of read coverage across the SARS-CoV-2 genome (log scale). Amplicons were generated using NEBNext® VarSkip Short SARS-CoV-2 v2 primer pools, NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 primer pools, NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 primer pools (ARTICv3), MilliporeSigma ARTICv4 primer pools plus IDT ARTICv4.1 spike-in primers (ARTICv4.1), or MilliporeSigma ARTICv4 primer pools. The same Omicron variant SARS-CoV-2 viral gRNA clinical sample served as a template for all primer schemes except ARTICv3. Libraries were constructed using the NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina®) and sequenced on a MiSeq® instrument (2x75 bp). Coverage depth per base was determined, reads were down-sampled to 0.5M PE reads with seqtk and aligned to SARS-CoV-2 reference genome (NCBI, NC_045512) with Bowtie2.

 

 

 

 

図 8:オミクロン株にも対応 (VarSkip Short  v2 Primer)

 

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Integrative Genome Viewer visualization of read coverage across the SARS-CoV-2 genome (log scale). Amplicons were generated using NEBNext® VarSkip Short SARS-CoV-2 v2 primer pools, NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 primer pools, NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 primer pools (ARTICv3), MilliporeSigma ARTICv4 primer pools plus IDT ARTICv4.1 spike-in primers (ARTICv4.1), or MilliporeSigma ARTICv4 primer pools. The same Delta variant SARS-CoV-2 viral gRNA clinical sample served as a template for all primer schemes except ARTICv3. Libraries were constructed using the NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 FS Library Prep Kit (Illumina®) and sequenced on a MiSeq® instrument (2x75 bp). Coverage depth per base was determined, reads were down-sampled to 0.5M PE reads with seqtk and aligned to SARS-CoV-2 reference genome (NCBI, NC_045512) with Bowtie2.

 

[Information on primer overlaps with Omicron and Delta variants]

 

 

 

図 9:NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 ワークフロー(Illumina 用)

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別途必要な試薬等

アダプターオリゴ

・Magnetic rack/stand (NEB #S1515, Alpaqua, cat. #A001322 or equivalent) など(詳細はマニュアル参照)


*アダプターオリゴ(インデックスプライマー)選択のガイドライン:

・NextSeq 1000/2000、NovaSeq、Index hopping が生じうるシーケンサー

→NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Unique Dual Index Primer Pairs):E6440、E6442、E6444、E6446


・MiSeq、NextSeq 500/550

→低プレックスの場合は E7335S、高プレックスの場合は E6609 や E6440 など


・MiniSeq

→低プレックスの場合は E7335S、高プレックスの場合は E6609 など

キット内容

注意:

・本製品は 2 箱から構成されています。それぞれ保存温度が異なることにご留意ください。

・ライブラリー調製には別途必要なものがあります。

 

【Package 1:-20℃ 保存】

・LunaScript RT SuperMix

・Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix

・NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer Mix 1

・NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer Mix 2

・NEBNext ARTIC Human Control Primer Pairs 1

・NEBNext ARTIC Human Control Primer Pairs 2

・NEBNext Ultra II FS Enzyme Mix

・NEBNext Ultra II FS Reaction Buffer

・NEBNext Ultra II Ligation Master Mix

・NEBNext Library PCR Master Mix

・0.1X TE

・Nuclease-free Water

New NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 Primer Mix 1

New NEBNext VarSkip Short v2 SARS-CoV-2 Primer Mix 2


【Package 2:室温保存】

・NEBNext Sample Purification Beads

技術資料

よくあるご質問(英語)

・参考文献 (1):Josh Quick nCoV-2019 sequencing protocol v2 (GunIt). protocols.io.

 

NEB Japan Webinar 他の動画を見る 
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 新型コロナウイルスの全ゲノムシーケンスと NEB の取り組み (日本版)

 

 

 

 

新プライマー:VarSkip Short Primer の FAQ

Q1.  VarSkip Short v2 Primer とは何ですか?
 

新型コロナウイルスのさらなる変異株のゲノム解析のために、既存の VarSkip Short Primer をベースとして新しく開発された cDNA 増幅用のプライマーです。ウイルス RNA ゲノムを逆転写した後、PCR で増幅、約 550 bp の cDNA を取得してライブラリー調製を行います。

なお、既存の NEBNext ARTIC v3 プライマーは hCoV-2019/nCoV-2019 Version 3 と同じ配列でプライマーバランスを最適化したものであり、約 400 bp の cDNA を増幅します。

   
Q2.  今までのプライマーを使ってきましたが、新しいキットからはつかえなくなるのですか?
 

VarSkip Short Primer (バージョン 1) は新バージョンである VarSkip Short v2 Primer に置き換えられましたので、キット内には含まれていません。もしバージョン 1 が必要な場合、弊社テクニカルサポートまでご依頼ください。


なお、NEBNext ARTIC v3 プライマーは今までどおりキット内に含まれていますので、ご利用いただけます。

   
Q3.  既存の NEBNext ARTIC v3 と VarSkip Short v2 Primer を同時に使うことはできますか?
  できません。必ずどちらか一方をご使用ください。
   
Q4.  NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Library Prep Kit (NEB#E7650S/L) には VarSkip Short v2 Primer は付属しないのですか?
 

はい、付属していません。VarSkip Primer は約 550 bp の cDNA を合成・増幅します。これをシーケンスするためには MiSeq の 2 x 300 サイクルシーケンスが必要であり、キット推奨の 2 x 250 bp では中央にリードギャップを生じるため、あえて VarSkip Primer を付属していません。もしご興味があれば、テクニカルサポートまでご連絡ください。 

   
Q5.  VarSkip Short v2 Primer の配列情報は公開されていますか?
 

はい、以下に公開をしています。

・VarSkip Short:https://github.com/nebiolabs/VarSkip

・NEBNext ARTIC v3:https://github.com/joshquick/artic-ncov2019/blob/master/primer_schemes/nCoV-2019/V3/nCoV-2019.tsv

   
Q6.  VarSkip Short v2 Primer を使用して取得したシーケンスデータはどのように解析すればよいのでしょうか?
 

以下にシーケンス解析パイプラインを公開していますので、これをご参照ください。

https://github.com/nebiolabs/VarSkip

備考

1)NEBNext ARTIC SARS-CoV-2 Primer の配列はARTIC Network V3 primers と同じである。配列は GitHub nCoV-2019 に公開されている。VarSkip Short Primer は NEB で設計したものであり、https://github.com/nebiolabs/VarSkip に配列を公開している。

 

2)取得すべきシーケンスデータ量は、RNA インプットの量と質によって異なる。0.5 million reads を基準として、希望する coverage が得られるリード数に最適化する。

 

3)RNA インプット量について、Ct 32 以下のものが良い。

 

4)データ解析について、nfcore/viralreconCOVID-19 analysis on usegalaxy などが使用できる。

 

5)本キットで調製したライブラリーは十分な複雑性を有するため、通常は PhiX の添加は不要である。しかしながら、シーケンスラン自体のコントロールとして >1% PhiX を添加しておくとよい。

 

6)cDNA 増幅に使用するプライマーは ARTIC protocol v3 の配列と共通しているが、プロトコールが若干異なる。本キット使用時には必ず本キットのマニュアルに従う。

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