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NEBNext Immune Sequencing Kit (Human)

NEBNext Immune Sequencing Kit (Human) カタログ番号:E6320

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

E6320S 24 rxns ¥298,000 ¥223,500 -20C/4C
E6320L 96 rxns ¥1,020,000 ¥765,000 -20C/4C

製品カテゴリ>グループ

  • NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用(DNA, ChIP, mRNA, Small RNA)

備考

  • 備考:2021年度末キャンペーン(2021/12/1~2022/2/18)

特徴

免疫レパトアシーケンス用ライブラリー調製キット(Human)

Mouse 用

 

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本製品は B 細胞および T 細胞の免疫レパトアをシーケンスするためのライブラリー調製キットである。トータル RNA から B/T 細胞受容体 (BCR/TCR) の可変領域の完全長 cDNA を濃縮・合成して、イルミナ用ライブラリーを調製する。関連するすべてのコンテクスト (V, D, and J segments および isotypes IgM, IgD, IgG, IgA, IgE) における体細胞変異が高精度でプロファイリングできる。また BCR L 鎖、BCR H 鎖、TCRα 鎖、TCRβ 鎖の解析が可能。ライブラリーには分子バーコード (UMIs) が付加される。

 

特長:

・B/T 細胞受容体(BCR/TCR)の可変領域の完全長 cDNA を同時に濃縮してライブラリー調製

・生体内の免疫状態や疾患・感染による免疫多様性(レパトア)の変化の解析、残存病変の検出などに利用

・末梢血単核球(PBMC)や組織由来などのトータル RNA からライブラリーを調製

・分子バーコード(UMI) により PCR バイアスを低減、正確な発現解析が可能

データ解析ガイド(pRESTO, Galaxy)を公開



図1:BCR および TCR の構造と多様性

 

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BCR と TCR の多様性は V (variable) 遺伝子、D (diversity) 遺伝子、J (joining) 遺伝子の組み換えにより生じる。ゲノム上の複数の遺伝子から、各細胞が 1  遺伝子ずつを選択する。これらの遺伝領域が相補性決定領域 (CDR3) であり、各 BCR と TCR に特有の CDR3 配列をクロノタイプと呼ぶ。

 


図2:ワークフロー

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図3:分子バーコード (UMIs) による正確なクロノタイプの定量

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10 ng および 100 ng の T 細胞トータル RNA からライブラリーを調製してシーケンスを行い、UMIs の有無によるクロノタイプ頻度を比較した。10 ng のトータル RNA を用いた時にも UMI によってクロノタイプの定量が可能となることが示された(図A、With UMIs)。

 

 

図4:BCR と TCR ライブラリーを同時に調製

 

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各量 (1 ug1、100 ng、10 ng) の ヒト PBMC Total RNA (Takara Bio #636592) から N=2 で BCR/TCR ライブラリーを調製、シーケンスをして950,000 リードまでダウンサンプル、pRESTO ツールでクオリティフィルタリング、シーケンスアッセンブル、コンセンサス配列の作成をした。続いて MiGMAP で V、D、J にアサインした。

 

A) 各インプット量に対するクロノタイプ検出数

B) BCR/TCR の各鎖にマッピングされたリード割合

別途必要な試薬等

・SYBR Green (Life Technologies #S7563)

・80% Ethanol (用事調製)

・DNA LoBind® Tubes (Eppendorf #022431021 など)

・Magnetic rack/stand

・Thermal cycler

・qPCR machine

・Bioanalyzer®/TapeStation®

キット内容

注意:

・本製品は 2 箱および 1 パウチから構成されています。それぞれ保存温度が異なることにご留意ください。

・ライブラリー調製には別途必要なものがあります。


【Package 1:-20℃ 保存】

・NEBNext® IS 4 X RT Buffer

・NEBNext® Cell Lysis Buffer  

・dNTP Solution Mix

・NEBNext® IS RT Primer

・NEBNext® IS TS Oligos

・NEBNext First Strand Synthesis Enzyme Mix

・Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase

・Q5® Reaction Buffer

・NEBNext® IS PCR2 Universal Primer

・0.1X TE

・Nuclease-free Water

・NEBNext i701 - i712 Primers (12 種類)

・NEBNext i501 - i508 Primers (8 種類)


【Package 2:室温保存】

・Streptavidin Magnetic Beads

・NEBNext IS Bind and Wash Buffer (2X)

・0.1% Tween

・NEBNext Sample Purification Beads (製品受け取り後は室温保存)


【Pauch 1:-20℃ 保存】

・NEBNext® IS BCR Primers (Human)

・NEBNext® IS TCR Primers (Human)

解析ツールおよび参考文献

【解析ツール】

・データ解析ガイド(英語)

 

【参考文献】

・Turner JS, et al. (2021) SARS-CoV-2 mRNA vaccines induce persistent human germinal centre responses. Nature; DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-021-03738-2

 

・Jiang R, et al. (2020) Single-cell repertoire tracing identifies rituximab-resistant B cells during myasthenia gravis relapses. JCI Insight; 5(14):e136471, DOI: https://doi.org/10.1172/jci.insight.136471

 

【オンラインセミナー】

Webinar:Using large scale B cell receptor repertoire sequencing to further understand human autoimmune disease