NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit (E6655)

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NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit

NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit

NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kitカタログ番号:E6655

カタログ番号	サイズ	濃度	価格（税別）	保存温度
E6655S	24 rxns		~~¥154,000~~ ¥107,800	-20C/室温
E6655L	96 rxns		~~¥585,000~~ ¥409,500	-20C/室温

製品カテゴリ>グループ

NEBNext次世代シーケンサー用ライブラリー調製試薬>Illumina用(DNA, ChIP, mRNA, Small RNA)

備考

備考：新製品発売記念キャンペーン（2023年11月7日から2024年2月2日まで）　新製品（2023年9月19日）

特徴

FFPE DNA サンプルのための NGS ライブラリー調製キット（Illumina 社用）

FFPE DNA は、一般的に検体から精製/回収できる DNA 量が少ないためにライブラリーが調製できない、固定/保存/抽出方法および保存期間による DNA への損傷が非常に多様であるためライブラリーの品質が低い (保存中に生じた変異がシーケンスリードに残る) など、NGS ライブラリー調製に多くの課題をもたらす。

NEB はこれまでに DNA ライブラリー調製の前処理に使う NEBNext FFPE DNA Repair v2 Module (NEB #E7360) を開発・販売してきた。これは FFPE DNA を初めに修復して、一般的な DNA ライブラリー調製を行うというワークフローである。今回、FFPE DNA 専用の断片化酵素と PCR 酵素、各反応のバッファーや条件、全体のワークフローを最適化することで、より高収量かつ正確なライブラリーを調製できる本キットを開発した。

特長：

・5 ng の FFPE DNA からライブラリー調製 (5 – 250 ng に対応)

・分解が進んだ FFPE DNA (DIN = 1～2) からも調製

・DNA 損傷を削除ではなく修復するため、シーケンスデータのクオリティを向上

・体細胞変異の感度を向上

・自動化対応

・FFPE DNA 専用の断片化酵素、修復キット、ライブラリー調製試薬、精製ビーズを含む (インデックスは別売)

※断片化酵素なしの NEBNext FFPE DNA Library Prep Kit (NEB #E6650) も別途提供しているが、これは分解度が低く、断片化をコバリスなど物理的に行いたい場合に使用する。基本的には全ての FFPE DNA に対して本キットの使用を推奨する。

図１：ワークフロー

NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit は、5 - 250 ng のインプット範囲において、最小限のハンズオン時間で合理的なワークフローを実現する。

図２：様々な量や品質のサンプルからロバストなライブラリー調製が可能

DNA Integrity Number (DIN) = 1.8 ～ 6.8 の 5, 50, 250 ng 正常組織 FFPE DNA から、指定された PCR サイクルでライブラリーを調製した。ライブラリーは、5 ng および 50 ng のインプットでは 3 回、250 ng では 1 回実施した。それぞれのデータは 3 回の平均値を表し、エラーバーは 5 ng および 50 ng インプットの標準偏差を示す。ライブラリーの収量は、サンプルの質およびインプット量にかかわらず、ロバストであった。ほとんどのターゲット濃縮ワークフローでは、ハイブリッドキャプチャーのインプットに 200 ng のライブラリーが必要となる。NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit では、最小 50 ng の FFPE DNA で十分なライブラリー収量が得られる。

図３：ライブラリーの品質を改善する

NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kit を用いて、100 ngの低品質（DIN 1.8）正常組織由来のFFPE DNAからライブラリーを調製した（PCRは９サイクル、N=2）。断片化酵素を含む、他のFFPE向けのライブラリー調製キットと比較した。なお、アダプターは各ベンダーの推奨アダプターを用いた。ライブラリーはIllumina NovaSeq6000（2 x 100 base reads）でシーケンスし、500万ペアエンドリードにダウンサンプリングした。リードはBowtie2（バージョン2.3.2.2）を用いてGRCh38リファレンスにマッピングし、duplicateリードはPicard MarkDuplicates（バージョン1.56.0）を用いてマークした。ライブラリーはPicard Alignment Summary Metrics (version 1.56.0)を用いて品質を評価した。foldbackリード量はSeq_frag_remap（バージョン0.2）を用いて計算した。NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kitは、マッピングされていないリード、キメラリード、ペアリングされていないリード、foldbackリードの割合を減少させることで、ライブラリーの質を向上させることが示された。

図4：シーケンシングアーティファクトを減少させる

NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kitを用いて、100 ngの低品質（DIN 1.8）正常組織由来のFFPE DNAからライブラリーを調製した（PCRは９サイクル、N=2）。断片化酵素を含む、他のFFPE向けのライブラリー調製キットと比較した。なお、アダプターは各ベンダーの推奨アダプターを用いた。ライブラリーはIllumina NovaSeq6000（2 x 100 base reads）でシーケンスし、500万ペアエンドリードにダウンサンプリングした。リードはBowtie2（バージョン2.3.2.2）を用いてGRCh38リファレンスにマッピングし、duplicateリードはPicard MarkDuplicates（バージョン1.56.0）を用いてマークした。Tasmanian (version 1.0.7)を用いて、Read 1とRead 2の各C位(A)のC→T変異と各G位(B)のG→T変異の平均頻度を計算した(N=2)。低品質FFPE DNA中のシトシン脱アミノに起因するC→T変異および酸化損傷に起因するG→T変異は、NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kitに含まれるNEBNext FFPE DNA Repair v2 Mixによって効果的に修復される。他のキットでは、DNA損傷の修復が不十分なため、低品質のFFPE DNAではC→TやG→Tのアーティファクトが発生する。

図5: ハイブリッドキャプチャーとの組み合わせで良好なカバレッジが得られる

NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kitを用いて、100 ngの低品質（DIN 1.8）正常組織由来のFFPE DNAからライブラリーを調製した（PCRは９サイクル、N=2）。断片化酵素を含む、他のFFPE向けのライブラリー調製キットと比較した。なお、アダプターは各ベンダーの推奨アダプターを用いた。得られたライブラリーの全量をカスタムがんパネル（Twist Bioscience®）によるシングルプレックスターゲットエンリッチメントに使用し、ライブラリーをIllumina NovaSeq 6000（2×100ベースリード）でシーケンスした。1500万ペアエンドリードをFastp（バージョン0.20.0）でトリミングし、BWA mem（バージョン0.7.17）でT2Tリファレンスにマッピングした。duplicateはPicard MarkDuplicates (version 2.20.6)とUMIを用いてマークした。ターゲットエンリッチメントの品質指標は、Picard HS Metrics (version 2.18.29)を用いて評価した。NEBNext UltraShear FFPE DNA Library Prep Kitでは、全ゲノムシーケンス（WGS）において収量、カバレッジ、使用可能リードの割合が向上した。これは、ターゲットエンリッチメントライブラリーにおけるカバレッジ、オンターゲット率、カバレッジ均一性の向上と相関している。