Endo H
カタログ番号 |
サイズ |
濃度 |
価格(税別) |
保存温度 |
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P0702S | 10,000 units | 500,000 units/ml | ¥14,600 | -20C |
P0702L | 50,000 units | 500,000 units/ml | ¥57,600 | -20C |
製品カテゴリ>グループ
- 糖鎖生物学&プロテインツール>グリコシダーゼ
備考
- 備考:価格改定 (2023年4月1日)
特徴
2015年3月より製品付属の反応バッファーの名称および組成が変更されました。詳細はこちら
特長:
・糖タンパク質から高マンノース型N結合型糖鎖を除去
・タンパク質に単糖を残して糖鎖を切断
・タンパク質の糖鎖修飾部位を解析可能
説明:
Endoglycosidase H(Endo H)は、高マンノースのキトビオースコア内部やN 結合型糖タンパク質のハイブリッドオリゴ糖内部で糖鎖を切断するグリコシダーゼである。Endo Hはタンパク質に単糖を残して糖鎖を切断するので、切断後にタンパク質の糖鎖修飾部位(アミノ酸残基)を解析することができる。
高マンノース構造:n=2~150、X=(Man)1-2、Y=H
ハイブリッド型オリゴ糖構造:n=2、X and/or Y=AcNeu-Gal-GlucNAc
由来:
リコンビナント酵素(Streptomyces plicatus由来の遺伝子を大腸菌で発現)
付属試薬:
・Glycoprotein Denaturing Buffer (10X)
・GlycoBuffer 3 (10X)
プロトコール
酵素特性および使用方法
ユニット定義:
1 unitは全反応溶液10 μl中、37℃、1 時間で変性させた10 μgのRNase B から95% 以上の糖を除去するために必要な酵素量として定義(10 NEB units =1 IUB milliunit)
ユニットアッセイ条件:
10 ugのRNase Bを1X Glycoprotein Denaturing Buffer (0.5% SDS, 40 mM DTT)中、100℃、10分間の変性。GlycoBuffer 3およびEndo Hを加えて37℃で1時間インキュベーション。反応後SDS-PAGEのバンドシフトアッセイにより脱グリコシル化を確認。
反応条件:
糖タンパク質を1X Glycoprotein Denaturing Buffer(0.5% SDS、40 mM DTT)中で100℃、10 分間変性、1X GlycoBuffer 3中で、37℃でインキュベーション
1X Glycoprotein Denaturing Bufferの組成:
・0.5% SDS
・40 mM DTT
保存温度:
-20℃
酵素保存液の組成:
・20 mM Tris-HCl
・50 mM NaCl
・5 mM Na2EDTA
pH 7.5 @ 25°C
熱による不活性化:
75℃、10分間
分子量:
約29 kDa
メモ
1. Endo HはSDSで阻害されない。
2. 未変性の糖タンパク質の脱グリコシル化を行う場合、立体構造上Endo Hが切断サイトにアクセスしづらく、脱グリコシル化効率が低下する傾向にある。コントロールとして変性した糖タンパク質を使用して切断効率を確認すると良い。また酵素量およびインキュベーション時間、反応温度を最適化する。
3. コントロール基質としてRNase Bの使用を推奨する。PNGase Fで切断した場合、17 kDaから13 kDaへのバンドシフトが観察される。
4. 各温度でのEndo Hの活性は以下の通りである。
37℃:100%
30℃:65%
25℃:40%
17℃:25%
2℃:0%
5. Endo H (#P0702) とEndo Hf (P0703) の酵素活性は同じである。Endo Hにはタグが付いていないが、Endo Hfにはマルトース結合タンパク質が付加している。下記図は3,000 unitsのEndo HとEnd Hfを用いて60 ugのRNase Bを脱グリコシル化した時の様子を示す。