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MmeI

MmeIカタログ番号:R0637

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

R0637S 100 units 2,000 units/ml ¥12,500 -20C
R0637L 500 units 2,000 units/ml ¥50,600 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • 制限酵素>制限酵素

特徴

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認識配列:

Recognition

 | Isoschizomers

由来:
Methylophilus methylotrophus (W.J. Brammar)からクローニングされたMmeI遺伝子を有する大腸菌

 

付属試薬:

CutSmart Buffer (10X)

S-adenosylmethionine (32 mM)

酵素特性および使用方法

ユニット定義:

1ユニットは、全反応容量50 μl中、37℃で1時間において、1 μgのφX174 DNAを消化するために必要な酵素量として定義される。

 

反応条件:

1X CutSmart Buffer

50 µlのS-adenosylmethionineを添加

37℃でインキュベーション。

 

1X CutSmart Buffer 組成:

・50 mM Potassium Acetate
・20 mM Tris-acetate
・10 mM Magnesium Acetate
・100 μg/ml BSA
pH 7.9 @ 25°C

 

各バッファー中における活性:

NEBuffer 1.1  : 50 % 
NEBuffer 2.1  : 100 %
NEBuffer 3.1  : 50 % 
CutSmart Buffer  : 100 %

 

希釈バッファー:

Diluent B

 

保存温度:

-20℃

 

保存液組成:

・10 mM Tris-HCl
・300 mM NaCl
・0.1 mM EDTA
・500 μg/ml BSA
・50% Glycerol
・1 mM DTT
pH 7.4 @ 25°C

 

熱による不活性化:

65℃、20分間

 

メチル化感受性:

dam methylation  : 感受性なし
dcm methylation  : 感受性なし
CpG Methylation  : オーバーラップするメチル化配列によってブロックされる

品質管理

以下品質管理試験に基づいて各ロットが検証されている。

 

エキソヌクレアーゼ活性(同位体標識塩基のリリース)
  同位体標識した1本鎖DNAと2本鎖DNA、それに酵素を含む反応中において試験を実施。4時間のインキュベーションを行い、同位体標識したヌクレオチドのリリース率を決定。
   
ライゲーションおよびリカッティング
  制限酵素でDNAを過剰消化した後、T4 DNA Ligaseで再ライゲーションする割合、それにリカットできる割合をアガロース電気泳動で決定。
   
非特異的DNase活性(16時間)
  DNA基質を含む反応中において、非特異的DNAの分解を試験。16時間のインキュベーションの後、アガロースゲル電気泳動でDNAの分解が観察されないことを確認。

メモ

  1. 過剰のMmeIは切断をブロックする。MmeIを使った反応は、等モル付近で行われるべきである。
  2. 37℃では切断は15分間以内に完了する。氷上および50℃でもかなりの切断が起きる。
  3. 哺乳類ゲノムDNAの切断は、オーバーラップするCpGメチル化によってブロックされる。
  4. MmeIの活性は高イオン強度(> 200 mM)で阻害される。
  5. 最適条件にはS-アデノシルメチオニン(酵素に添付)が必要。
  6. 切断効率が低い場合、SAMを新たに調製したものを使用する。SAMの消費期限(製品チューブに記載)が短いことに注意する。
  7. 切断には2か所以上のMmeIサイトが必要である。詳細はこちらを参照する。

Legal and Disclaimers

Patents

New England Biolabs, Inc.
U.S. Patent No. 7,115,407