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I-SceI

I-SceIカタログ番号:R0694

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

R0694S 500 units 5,000 units/ml ¥12,500 -80C
R0694L 2,500 units 5,000 units/ml ¥50,500 -80C

製品カテゴリ>グループ

  • 制限酵素>ホーミングエンドヌクレアーゼ

特徴

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認識配列:

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説明:

I-SceIはSaccharomyces cerevisiae由来ミトコドリア内に存在するイントロンにコードされたホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼは2本鎖DNaseであり、その認識配列が非常に長く(12-40 bp)、パリンドローム配列でないことが特徴である。通常、イントロンまたはインテイン内にコードされている。イントロンはRNA前駆体からスプライシングされ、インテインはタンパク質前駆体から切り取られる。ホーミングエンドヌクレアーゼも制限酵素の命名法とほぼ同じ方法で命名されるが、イントロン内にコードされているものは「I-」が、インテイン内にコードされているものは「PI-」が接頭語として用いられる。

ホーミングエンドヌクレアーゼは一般的な制限酵素のように厳密な配列の認識はしない。例えば認識配列中の1塩基が異なっている場合、全く切断されないのではなく、切断効率が変化する (効率が低下することがほとんどである)。このように、切断に必要な認識配列に関してはまだ不明な点が残っているため、使用には注意が必要である。ただし各酵素の特異性に記載されている認識配列は、実際に切断されることが確認されている。

 

由来:

Saccharomyces cerevisiae (B. Dujon)からクローニングされたI-SceIミトコンドリア遺伝子を有する大腸菌

 

付属試薬:

・CutSmart Buffer (10X)

・pGP2 NotI-linearized Control Plasmid (500 μg/ml)

酵素特性および使用方法

ユニット定義:

1ユニットは、全反応容量50 μl中、37℃で1時間において、1 μgのpGP2 NotI-linearized Control Plasmidを消化するために必要な酵素量として定義される。

 

反応条件:

1X CutSmart Buffer

37℃でインキュベーション。

 

1X CutSmart Buffer 組成:

・50 mM Potassium Acetate
・20 mM Tris-acetate
・10 mM Magnesium Acetate
・100 μg/ml BSA
pH 7.9 @ 25°C

 

希釈バッファー:

Diluent B

 

保存温度:

-80℃

 

保存液組成:

・10 mM Tris-HCl

・300 mM NaCl

・1 mM DTT

・0.1 mM EDTA

・500 μg/ml BSA

・50% Glycerol

pH 7.4 @ 25°C

 

熱による不活性化:

65℃、20分間

品質管理

以下品質管理試験に基づいて各ロットが検証されている。

 

エンドヌクレアーゼ活性(ニッキング)
  スーパーコイル状DNAと酵素を含む反応中において試験を実施。4時間のインキュベーションを行い、ニック導入率をアガロース電気泳動で決定。
   
エキソヌクレアーゼ活性(同位体標識塩基のリリース)
  同位体標識した1本鎖DNAと2本鎖DNA、それに酵素を含む反応中において試験を実施。4時間のインキュベーションを行い、同位体標識したヌクレオチドのリリース率を決定。
   
ライゲーションおよびリカッティング
  制限酵素でDNAを過剰消化した後、T4 DNA Ligaseで再ライゲーションする割合、それにリカットできる割合をアガロース電気泳動で決定。
   
非特異的DNase活性(16時間)
  DNA基質を含む反応中において、非特異的DNAの分解を試験。16時間のインキュベーションの後、アガロースゲル電気泳動でDNAの分解が観察されないことを確認。

メモ

  1. I-SceIはDNA切断後もDNAと結合した状態になっていることが多い。そのため反応後の溶液に終濃度0.5%となるようにSDSを加えて室温で5分間インキュベーションしてから電気泳動することを推奨する。あるいは切断産物を精製しても良い。
  2. I-SceIを使用する際には本製品付属のコントロールDNAの使用を推奨する。50μlの反応液中、5μlのCutSmart Buffer、2μlのコントロールDNA(1μgに相当)、1μlのI-SceIを使用して37℃で1時間インキュベーションする。コントロールDNAは2499 bpであり、切断産物は1518bpと981bpである。