I-CeuI
カタログ番号 |
サイズ |
濃度 |
価格 |
保存温度 |
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| R0699S | 500 units | 5,000 units/ml | ¥14,000 | -20C |
| R0699L | 2,500 units | 5,000 units/ml | ¥57,200 | -20C |
製品カテゴリ>グループ
- 制限酵素>ホーミングエンドヌクレアーゼ
特徴
    |
認識配列：
説明：
I-CeuIはChlamydomonas eugametos由来クロロプラスト大サブユニットrRNA遺伝子内のイントロンにコードされたホーミングエンドヌクレアーゼである。ホーミングエンドヌクレアーゼは2本鎖DNaseであり、その認識配列が非常に長く(12-40 bp)、パリンドローム配列でないことが特徴である。通常、イントロンまたはインテイン内にコードされている。イントロンはRNA前駆体からスプライシングされ、インテインはタンパク質前駆体から切り取られる。ホーミングエンドヌクレアーゼも制限酵素の命名法とほぼ同じ方法で命名されるが、イントロン内にコードされているものは「I-」が、インテイン内にコードされているものは「PI-」が接頭語として用いられる。
ホーミングエンドヌクレアーゼは一般的な制限酵素のように厳密な配列の認識はしない。例えば認識配列中の1塩基が異なっている場合、全く切断されないのではなく、切断効率が変化する （効率が低下することがほとんどである）。このように、切断に必要な認識配列に関してはまだ不明な点が残っているため、使用には注意が必要である。ただし各酵素の特異性に記載されている認識配列は、実際に切断されることが確認されている。
由来：
Chlamydomonas eugametos (C. Lemieux) からクローニングされたI-CeuI遺伝子を有する大腸菌
付属試薬：
・CutSmart Buffer (10X)
・pBHS ScaI-linearized Control Plasmid (500 μg/ml)
プロトコール
酵素特性および使用方法
ユニット定義：
1ユニットは、全反応容量50 μl中、37℃で3時間において、1 μgのpBHS ScaI-linearized Control Plasmidを消化するために必要な酵素量として定義される。
反応条件：
1X CutSmart Buffer
37℃でインキュベーション。
1X CutSmart Buffer 組成：
・50 mM Potassium Acetate
・20 mM Tris-acetate
・10 mM Magnesium Acetate
・100 μg/ml BSA
pH 7.9 @ 25°C
希釈バッファー：
Diluent B
保存温度：
－20℃
保存液組成：
・10 mM Tris-HCl
・300 mM NaCl
・1 mM DTT
・0.1 mM EDTA
・500 μg/ml BSA
・50% Glycerol
pH 7.4 @ 25°C
熱による不活性化：
65℃、20分間
品質管理
以下品質管理試験に基づいて各ロットが検証されている。
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・ |
エンドヌクレアーゼ活性（ニッキング） |
| スーパーコイル状DNAと酵素を含む反応中において試験を実施。4時間のインキュベーションを行い、ニック導入率をアガロース電気泳動で決定。 | |
| ・ | エキソヌクレアーゼ活性（同位体標識塩基のリリース） |
| 同位体標識した1本鎖DNAと2本鎖DNA、それに酵素を含む反応中において試験を実施。4時間のインキュベーションを行い、同位体標識したヌクレオチドのリリース率を決定。 | |
| ・ | ライゲーションおよびリカッティング |
| 制限酵素でDNAを過剰消化した後、T4 DNA Ligaseで再ライゲーションする割合、それにリカットできる割合をアガロース電気泳動で決定。 | |
| ・ | 非特異的DNase活性（16時間） |
| DNA基質を含む反応中において、非特異的DNAの分解を試験。16時間のインキュベーションの後、アガロースゲル電気泳動でDNAの分解が観察されないことを確認。 |
メモ
- I-CeuIはDNA切断後もDNAと結合した状態になっていることが多い。そのため反応後の溶液に終濃度0.5%となるようにSDSを加えて室温で5分間インキュベーションしてから電気泳動することを推奨する。あるいは切断産物を精製しても良い。
- ホーミングエンドヌクレアーゼには厳密に定義された認識配列はない。そのため1塩基異なる認識配列も切断することがある。この場合には切断効率が低下するが、低下率は配列によって異なる。本サイトに記載されている認識配列は現時点で認識・切断ができる配列の1つである。
- I-CeuIを使用する際には本製品付属のコントロールDNAの使用を推奨する。50μlの反応液中、5μlのCutSmart Buffer、2μlのコントロールDNA（1μgに相当）、1μlのI-CeuIを使用して37℃で1時間インキュベーションする。コントロールDNAは3.5 kbであり、切断産物は2100 bpと1400 bpである。
