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EcoRV-HF

EcoRV-HFカタログ番号:R3195

カタログ番号

サイズ

濃度

価格

保存温度

R3195S 4,000 units 20,000 units/ml ¥8,600 -20C
R3195T 4,000 units 100,000 units/ml ¥8,600 -20C
R3195L 20,000 units 20,000 units/ml ¥34,700 -20C
R3195M 20,000 units 100,000 units/ml ¥34,700 -20C

製品カテゴリ>グループ

  • 制限酵素>ハイフィデリティー(HF)制限酵素
  • 制限酵素>制限酵素

特徴

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認識部位:

Recognition

 | Isoschizomers

 

説明:
ハイフィデリティー(HF)制限酵素は 1) CutSmartバッファーで切断可能、2) 5-15分間で切断可能、3) スター活性を極限まで低減、の特長を兼ね備えた次世代型制限酵素である。200種類の制限酵素がCutSmart Bufferで切断可能である。

ハイフィデリティー(High-Fidelity, HF)制限酵素の詳細はこちら

 

由来:

プラスミドJ62 pLG74(L.I. Glatman)からクローニングされ、遺伝子改変(D19A, E27A)されたEcoRV遺伝子を有するE. coli株。 

 

付属試薬:

・CutSmart Buffer (10X)

・Gel Loading Dye, Purple (6X)

酵素特性および使用方法

ユニット定義:

1ユニットは、全反応容量50 μl中、37℃で1時間において、1 μgのλ DNAを消化するために必要な酵素量として定義される。

 

反応条件:

1X CutSmart Buffer

37℃でインキュベーション。

 

1X CutSmart Buffer 組成:

・50 mM Potassium Acetate
・20 mM Tris-acetate
・10 mM Magnesium Acetate
・100 μg/ml BSA
pH 7.9 @ 25°C

 

各バッファー中における活性:

NEBuffer 1.1  : 25 % 
NEBuffer 2.1  : 100 %
NEBuffer 3.1  : 100 % 
CutSmart Buffer  : 100 %

 

希釈バッファー:

Diluent B

 

保存温度:

-20℃

 

保存液組成:

・10 mM Tris-HCl
・200 mM NaCl
・1 mM DTT
・0.1 mM EDTA
・200 μg/ml BSA
・50% Glycerol
pH 7.4 @ 25°C

 

熱による不活性化:

65℃、20分間

 

メチル化感受性:

dam methylation  : 感受性なし
dcm methylation  : 感受性なし
CpG Methylation  : オーバーラップするメチル化配列の幾つかの組み合わせによって影響を受ける

品質管理

以下品質管理試験に基づいて各ロットが検証されている。

 

青/白スクリーニングアッセイ

  10倍過剰の制限酵素でDNAベクターを線状化し、再ライゲーションした後、LacZ beta遺伝子を発現する大腸菌株に形質転換し、白コロニーの出現頻度が1%未満であることを確認。
   

エンドヌクレアーゼ活性(ニッキング)
  スーパーコイル状DNAと酵素を含む反応中において試験を実施。4時間のインキュベーションを行い、ニック導入率をアガロース電気泳動で決定。
   
エキソヌクレアーゼ活性(同位体標識塩基のリリース)
  同位体標識した1本鎖DNAと2本鎖DNA、それに酵素を含む反応中において試験を実施。4時間のインキュベーションを行い、同位体標識したヌクレオチドのリリース率を決定。
   
ライゲーションおよびリカッティング
  制限酵素でDNAを過剰消化した後、T4 DNA Ligaseで再ライゲーションする割合、それにリカットできる割合をアガロース電気泳動で決定。
   
非特異的DNase活性(16時間)
  DNA基質を含む反応中において、非特異的DNAの分解を試験。16時間のインキュベーションの後、アガロースゲル電気泳動でDNAの分解が観察されないことを確認。

 

メモ

  1. pBR322のテトラサイクリン耐性遺伝子を切断し、ライゲーション可能な平滑末端を産生する。
  2. 哺乳類ゲノムDNAの切断は、オーバーラップするCpGメチル化によってブロックされる。
  3. EcoRV-HFはEcoRV (NEB #R0195)と同様のDNA切断活性を有するが、スター活性が低減されている。